마취된 마우스의 간질 초점에 GABA의 전기영동 전달

초록

출처: Slezia, A. et al. 간질 초점에 γ-아미노부티르산(GABA)을 전기영동으로 전달하면 생쥐의 발작을 예방할 수 있습니다. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 마취된 마우스에서 발작 활성을 억제하기 위한 감마-아미노부티르산(GABA)의 전기영동 전달을 보여줍니다. 치료 효능을 평가하기 위해 프로브 이식, 신경 활동 기록, 발작 유도 및 미세유체 이온 펌프를 통한 제어된 GABA 전달과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술/개두술

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1. 취된 마우스의 머리를 정위 고정 프레임에 고정합니다. 30G 바늘을 사용하여 국소 진통제 로피바카인(5μL, 7.5mg/mL, 재료 표 참조)을 계획된 절개 부위에 피하 주사합니다. 적용될 때까지 5분 정도 기다리십시오.
2. 메스로 두개골 위 피부에 정중선을 직선으로 자릅니다. 가는 집게로 피부를 옆으로 부드럽게 당기고 불독 세레파인 클램프로 옆으로 고정하여 추가 작업을 위해 두개골을 노출시킵니다.
3. 메스 또는 이와 유사한 도구로 근막의 두개골을 청소하십시오. 표재성 출혈의 경우 면봉이나 작은 종이 타월 조각으로 혈액을 제거하십시오.
4. 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) 폴리스티렌 설포네이트(PEDOT:PSS) 코팅 접지 나사(크기: #00, 직경: 0.047인치, 길이: 1/8인치, 재료 표 참조)를 납땜 와이어로 가져와 커넥터로 연결
하십시오.
5. 원하는 구멍 부위에 두개골을 적시고 경막이 보일 때까지 소뇌 위의 두개골에 미세하고 둥근 드릴 비트(직경 0.4mm)를 사용하여 고속으로 구멍을 뚫습니다. 접지 나사를 구멍에 넣고 소뇌 상단에 도달할 때까지 정밀 드라이버로 조입니다.
   참고: 헤드 스크류는 중량 기준으로 1% 3-글리시딜옥시프로필)트리메톡시실란(GOPS)을 함유한 PEDOT:PSS 용액으로 딥 코팅한 후 140°C에서 90분 동안 베이킹했습니다. PEDOT:PSS는 생체 적합성이 있는 것으로 알려진 체적 정전 용량을 갖는 공액 폴리머입니다. GOPS는 수성 매질에서 안정성을 높이기 위해 PEDOT:PSS와 혼합된 가교제입니다(그림 1).
6. 정위 프레임의 도움으로 원하는 뇌 영역에 대한 정위 좌표를 측정합니다. 예를 들어, 관심 영역은 생쥐의 뇌 아틀라스를 기반으로 Bregma 지점에서 1.8mm 떨어진 해마, 전후방(AP) -1.8mm 및 내측(ML)입니다.
   참고: 이들은 우반구의 좌표입니다(그림 1).
7. 얇고 잘 연마된 투명한 뼈막이 남을 때까지 빠른 속도로 설정된 신뢰할 수 있는 치과용 드릴( 재료 표 참조)을 사용하여 대상 부위 위의 두개골 직경 약 1-2mm 영역을 얇게 만듭니다.
8. 그런 다음 골막의 두께가 충분히 얇으면(<200μm) 얇은 집게로 작은 구멍을 뚫고 뼈의 얇은 층을 부드럽게 제거합니다. 맞춤형 후크 팁 바늘을 사용하여 경막을 제거합니다. 부종의 발생을 예방하고 뇌의 심장 및/또는 호흡 맥동을 최소화하기 위해 개두술 및 경막절개술의 크기를 최소화합니다.
   참고: 개두술은 건조를 방지하기 위해 식염수 방울로 채워야 하며 실험 중에 정기적으로 다시 채워야 합니다(그림 1).

2. 다중 채널 실리콘 프로브 삽입

1. 실리콘 프로브에 약간의 AP 각도(20°)로 정위 암을 사용하여 다른 두 임플란트의 위치를 지정할 수 있는 충분한 공간을 남기고 전극, 이온 펌프 및 마이크로피펫의 기록 및 주입 부위를 가능한 한 가깝게 만듭니다.
   참고: 전극, 주사기 및 이온 펌프를 DiI 염색 용액(1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸린도카르보시아닌 과염소산염[DiI]) 한 방울로 덮어 이식 흔적(디메틸 설폭사이드의 0.5mg/ml DiI)을 사후 시각화했습니다.
2. 마그네틱 홀더에 부착된 정위 암에 실리콘 프로브를 놓고 정위 프레임 옆에 놓습니다. AP 각도(20°)를 설정한 다음 프로브를 헤드에 연결합니다.tage 접지 나사.
3. 측면 이동을 피하기 위해 미크론 정밀한 정위 암 또는 전동 미세 조작기를 사용하여 실리콘 프로브를 해마로 천천히 내립니다(그림 1 및 그림 2).
   1. 녹화 소프트웨어를 시작하고 헤드스테이지, 연결된 증폭기 및 컴퓨터로 전기 신경 신호를 기록하면서 다중 채널 실리콘 프로브를 피질 상단에서 목표 배복부(DV) 위치(피질 표면에서 -1,800μm)에 도달할 때까지 이동합니다. 침투하는 동안 컴퓨터 화면에 로컬 필드 전위 신호(LFP)를 기록하고 관찰합니다.
      참고: 프로브가 기록하는 동안 천천히 연속적으로 움직이도록 프로브의 하강을 제어하여 침투 및 목표 영역에 도달하는 데 더 나은 시각적 제어를 제공합니다.
   2. 기록된 LFP에서 해마 형성의 피라미드 층에 있는 리플 활동을 표적 영역의 마커로 사용합니다.
      참고: 리플 활동은 기록 부위 사이에 100μm 거리를 갖는 다중 채널 실리콘(Si) 프로브의 하나 또는 두 개의 인접 채널에서 볼 수 있습니다(그림 3).
   3. 다중 채널 Si 프로브를 사용하여 다중 채널 증폭기의 소프트웨어( 재료 표 참조)를 통해 피질과 해마 층의 LFP 신호를 동시에 기록합니다(그림 3).

3. 미세유체 이온 펌프(μFIP) 삽입

1. 튜브( 재료 표 참조)를 μFIP의 입구에 연결하고 프로브에 0.05M 감마-아미노부티르산(GABA) 용액을 채웁니다. 튜브를 제거하고 파라핀 필름 포장으로 입구를 닫습니다. 전기 리드를 소스 측정 장치에 연결합니다.
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2. 위 암을 사용하여 μFIP를 내외측(MP) 각도(20°)로 삽입합니다. Si 프로브는 전체 프로세스 동안 삽입된 상태로 유지됩니다.
   참고: μFIP는 매우 유연하며 뇌 표면에 도달할 때까지 똑바로 유지하기 위해 작고 깨끗한 붓의 지지가 도움이 될 수 있습니다. 이 단계 후에 축 방향 이동으로 μFIP를 부드럽게 낮출 수 있습니다.
3. 축 방향 이동으로 μFIP를 천천히 내리고 배복부(DV) 좌표(피질 표면에서 -1,200μm)에 도달할 때까지 궤적 중에 구부러지지 않도록 하십시오.
   참고: μFIP 팁에서 출구의 300μm 거리를 고려하여 두 장치(μFIP 및 실리콘 프로브)를 가능한 한 가깝게 배치하십시오.
   주의: 삽입하는 동안 장치와 커넥터 간의 기계적 문제를 피하십시오(그림 1B 및 그림 2B).

4. 발작 유도 장치 준비

1. 주사기의 금속 바늘(10μL)을 교체합니다( 재료 표 참조). 바늘을 고정하는 금속 부분을 제거하고 마이크로피펫(외경[OD]: 1.2mm, 내경[ID]: 0.75mm, 팁 직경: 20-50μm, 생크의 ± 0.5cm 테이퍼링)을 배치하고 고정한 다음 바늘 고정 요소를 교체합니다.
2. 4-아미노피리딘(4AP)(인공 뇌척수액[ACSF]에서 50mM)을 주입하기 위해 주사기와 부착된 붕규산 마이크로피펫을 20° 측면내측(LM) 각도로 배치합니다.
   주의: 주사기의 금속 바늘이나 팁이 50μm보다 큰 마이크로피펫을 사용하지 마십시오.
3. 자동 미세 주입 펌프를 사용하여 500 nL–1 μL의 50 mM 4AP를 추출합니다.

5. 4AP 주입을 위해 주사기에 부착된 유리 피펫 삽입

1. 주사기에 부착된 유리 마이크로피펫을 목표 DV 위치(-1,500μm)로 내린 다음 250nL의 4AP 용액을 주입합니다(그림 1 및 그림 2). 녹음 소프트웨어로 녹음을 시작합니다. 화면을 보고 첫 번째 발작 간기 스파이크가 나타날 때까지 기다립니다.
2. 첫 번째 발작 간기 스파이크가 나타나면 즉시 μFIP에 의한 GABA 전달을 시작합니다. 소스와 타겟 사이에 100초 동안 1V를 인가한 다음 1초 동안 30초 동안 꺼서 GABA를 전달합니다. 기록 소프트웨어의 도움으로 최소 2시간 동안 기록합니다.
   참고: 전달된 GABA의 총 질량은 약 1nmol입니다(그림 4).
3. 실험이 끝나면 삽입된 프로브와 접지 나사를 부드럽게 제거하고 정위 고정 장비에서 동물을 제거합니다. 동물은 약물의 과다 복용(i.p.100mg/kg 펜토바르비탈)을 사용하여 안락사시켰습니다. 호흡과 순환이 중단되어 사망이 확인되었습니다.

결과

그림 1: 두개골 경막 절개술 및 마우스 뇌의 임플란트 국소화. (A) 수술, 개두술 및 마우스 뇌의 임플란트 표적에 대한 개략도. (B) 세 장치의 이식을 위해 정위 좌표 및 각도를 사용했습니다. μFIP = 20° 내측(ML), -1,200μm DV(녹색). 다중 채널 실리콘 프로브 = 20° AP, -1,800 μm DV (파란색). 주사기가 있는 마이크로피펫 = 2...

재료