마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

초록

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 정위 주사

적절한

1. 공기 흐름을 보장하기 위해 수술실의 환기가 열려 있는지 확인하십시오. 유도 챔버에서 4% 이소플루란으로 마취하여 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 마취 후 머리를 면도하여 주사 부위를 준비합니다.
   1. 핀셋을 사용하여 혀를 아래와 옆으로 움직여 정위 고정 기구에 마우스를 놓습니다. 이빨이 슬롯에 떨어질 때까지 바이트 바를 입에 삽입한 다음 이어 바를 고정합니다. 마우스 본체가 가열 패드 위에 있고 코가 노즈콘에 있는지 확인하십시오. 4% 이소플루란을 노즈콘에 직접 넣습니다. 핀셋으로 발을 꼬집고 놀람 반사가 없는지 확인하여 마취를 확인합니다.
   2. 인공 눈물을 발라 눈을 윤활하십시오. 포비돈-요오드와 리도카인을 번갈아 가며 면봉으로 면봉질하여 주사 부위 준비를 마칩니다.
2. 메스를 사용하여 두피 중앙을 따라 작은 절개를 자릅니다. 필요한 경우 면봉과 과산화수소로 두개골을 말려 브레그마를 시각화하는 데 도움이 됩니다.
   1. 해부 스코프를 사용하여 두개골에서 브레그마를 찾고 드릴 팁을 브레그마에 놓습니다. x, y 및 z 평면에서 디지털 입체 좌표를 0(또는 기록)합니다.
   2. 헤드가 주둥이에서 꼬리 y축으로 수평이 되도록 하려면 드릴 비트를 람다에 놓고 z-좌표가 브레그마와 람다 모두에서 거의 같도록 헤드를 수평으로 맞
   춥니다.
   3. 헤드가 x축에서 수평이 되도록 하려면 드릴 비트를 y = 1/2 람다에 놓습니다. z 좌표가 시상 봉합사의 각 면(x = +/-1mm)에서 1mm와 같은지 확인하십시오. 람다의 왼쪽과 오른쪽으로 1mm에서 z-좌표에 차이가 있는 경우 두개골을 조정합니다.
3. 원하는 좌표 위에 드릴을 놓습니다. 치상회에는 bregma의 좌표 y = -1.9 및 x = +/- 1.1을 사용합니다. 드릴링하기 전에 이소플루란을 2%로 낮춘 다음 천천히 조심스럽게 두개골을 뚫습니다.
   1. 모든 구멍을 뚫은 후 채워진 주사기를 정위 고정 기구에 부착합니다. 주사기를 구멍 위의 중앙에 시각적으로 놓고 두개골에서 z 좌표를 0으로 만듭니다.
   2. 주사기를 가장 깊은 z 깊이까지 천천히 내립니다. 치상회의 경우 z 깊이는 -2.5, -2.4 및 -2.3입니다. 정위 인젝터를 사용하여 0.25μl/min의 속도로 주입을 시작합니다.
      가장
      1. 낮은 Z 깊이에서 주입이 완료된 후 1분 동안 기다린 다음 다음 좌표로 올려 다시 주입을 시작합니다. 모든 z-주입 좌표가 주입될 때까지 이 패턴을 계속합니다. 마지막 주사 후 주사기를 제거하기 전에 2분 동안 기다리십시오.
         참고: 마우스 뇌에 반구당 최대 2μl의 바이러스를 주입하여 조직에 부작용이 관찰되지 않았습니다.
   3. 다른 시추공에 대해 주입을 반복합니다.
4. 주사 후 정위 기구에서 마우스를 제거하고 6-0 실크 봉합사로 두피를 봉합합니다. 리도카인과 항균 크림을 상처에 바릅니다.
   통증을
   1. 관리하기 위해 복강내(IP) 경로를 통해 0.8-1.0ml 식염수 + 케토프로펜(3-5mg/kg)을 주입합니다. 그런 다음 마우스를 가열된 회수 챔버에 넣습니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 동물이 완전히 회복될 때까지 동물을 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Stereotacic Surgery Reagents
Vet-Syringe 수의사 사용 T.B. 주사기 전용 1cc 루어 슬립 T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
이소플루란
스테인리스 메스 블레이드, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
인공 눈물 연고	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
일반 식염수	Med-Vet International DYND500MLSH
코튼 팁 어플리케이터	Med-Vet International	CTA6
삼중 항생제 연고	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® 바늘 소프트 팩 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 실크 봉합사	Med-Vet International	MV-711