탈수초화된 마우스 모델에서 삼투압 펌프 기반 신경치료 약물 전달

초록

출처: Wang, X. et. al., 중추신경계에 대한 생체 내 재수초화 연구를 위한 삼투압 펌프 기반 약물 전달. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 탈수초화된 마우스 모델에서 삼투압 펌프를 사용하여 신경 치료 약물을 전달하는 방법을 보여줍니다. 제어된 약물 방출은 뇌량에서 미엘린 생성 세포를 활성화하여 재수초화를 촉진합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 리솔레시틴 유도 탈수초화 마우스 모델 확립

1. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 1% 리솔레시틴(L-α-리소포스파티딜콜린이라고도 함) 용액을 준비합니다.
가
2. 위, 겸자, 곡선 지혈제 및 기타 수술 기구를 오토클레이브 멸균으로 멸균합니다. 수술 부위를 소독하고 멸균 시트를 깔아주세요. 수술에 사용되는 모든 재료와 시약은 무균 상태로 준비해야 합니다. 시술 내내 수술 부위를 멸균 상태로 유지하는 것이 중요합니다.
3. 출생 후 56일째(P56) C57BL6 마우스를 다음과 같이 마취한다.
   1. 마우스를 소동물 마취기의 이소플루란 챔버에 놓습니다. O₂ 유량을 300-500 mL/min으로 조정하고 이소플루란을 3%-4%로 조정합니다. 충분한 마취 후 마우스가 느리고 안정적인 호흡으로 움직이지 않게 되면 마우스를 가열 패드가 있는 정위 장치로 옮깁니다.
   2. 챔버에서 마취 마스크로 가스 출력을 전환하고 이소플루란을 1%-1.5%로 조정하여 마우스를 마취 상태로 유지합니다. 마우스가 완전히 마취될 때까지 기다린 다음 케토프로펜(3-5mg/kg)을 복강 내 주사하여 통증을 완화합니다. 수술 전에 마우스의 발가락을 꼬집고 반응을 확인하여 성공적인 마취를 확인하십시오.
   3. 마우스가 마취되면 체온을 조절할 수 없습니다. 따라서 수술 중 마우스의 체온을 모니터링하고 조절하십시오. 마취 상태에서 안구를 촉촉하게 유지하기 위해 마우스의 안구 표면을 에리스로마이신 안구 연고로 덮습니다.
4. 톱니 바와 이어 바가 있는 정위 고정 장치에 마우스 헤드를 고정합니다. (그림 1A).
5. 면도기를 사용하여 머리 꼭대기의 머리카락을 제거하십시오. 베타딘과 75% 에탄올을 3주기 동안 머리 피부를 소독합니다. 윤리적 문제로 수술 부위를 제외한 동물의 몸을 덮습니다. 메스를 사용하여 목 밑에서 눈 사이까지 피부를 1cm 길이의 중간 시상 절개하여 두개골을 노출시킵니다(그림 1B).
6. 30% 과산화수소가 함유된 멸균 면봉으로 두개골 표면을 부드럽게 닦아 두개골 봉합사를 시각화합니다(그림 1C). 시상 봉합사가 수평이 되도록 치아 바와 이어바의 높이를 조정하여 람다 포인트와 브레그마 포인트를 동일한 높이(즉, 바늘 끝이 포인트에 닿을 때 동일한 z축 좌표로)에 배치합니다.
7. 마이크로리터 주사기 바늘(10μL, 33G)의 끝을 브레그마 지점에 부드럽게 놓고 x, y 및 z 좌표를 0으로 재설정합니다(그림 1D). 디지털 판독값의 프롬프트에 따라 주사기를 주사 부위(x: 1.04; y: 1.0, 즉, 정중선 측면 1.04mm, 브레그마 지점 뒤쪽 1.0mm)로 이동합니다(그림 1E).
8. 1mL 주사기 바늘(26G, 0.45mm)으로 경막을 관통하지 않고 주사 부위의 두개골을 통해 작은 버 구멍을 천천히 뚫습니다(그림 1F). 특정 깊이에 도달할 때까지 구멍을 통해 마이크로리터 주사기 바늘을 뇌 조직에 천천히 삽입합니다(대부분의 P56 마우스의 경우 z = -1.62mm)(그림 1G).
   참고: 경험적으로, -1.62mm의 삽입 깊이는 바늘 끝이 대부분의 P56 마우스의 뇌량의 중앙에 도달할 수 있도록 하여 리솔레시틴이 뇌량으로 직접 전달되어 탈수초화를 유도할 수 있습니다.
9. 1.5μL의 1% 리솔레시틴을 0.3μL/min의 속도로 주입합니다. 주사 후 5분 동안 기다렸다가 마이크로리터 주사기를 천천히 빼내어 주사 바늘 경로를 따라 액체가 누출되는 것을 방지하십시오.
10. 5-0 수술용 봉합사로 피부를 꿰매십시오(그림 1H).
11. 체온이 떨어지지 않도록 마우스를 가열 패드 위에 올려 놓으십시오. 통증을 완화하기 위해 24시간마다 5mg/kg 카프로펜을 피하 주사합니다. 상처가 제대로 치유되도록 매일 절개 부위에 에리스로마이신 연고를 바르십시오. 수술을 받은 쥐를 우리에 단독으로 넣고 완전히 회복될 때까지 촉촉한 음식을 먹입니다. 수술 후 매일 마우스를 모니터링하십시오.

2. 삼투압 펌프의 준비

참고: 펌프의 주요 구성 요소는 그림 2A에 나와 있습니다.

1. 뇌 주입 캐뉼라를 뇌에 삽입하는 깊이를 결정합니다. 사용하는 뇌 주입 캐뉼라의 바늘의 길이가 3mm이고 각 깊이 조절 스페이서가 0.5mm인지 확인하십시오. 1.5mm(뇌골에 가까움)의 주입 깊이를 달성하려면 조직 접착제로 뇌 주입 캐뉼라의 바늘에 3개의 깊이 조정 스페이서를 부착합니다(그림 2B, C).
2. 삼투압 펌프를 채우려면 펌프 패키지와 함께 제공되는 주사기 바늘을 1mL 주사기에 부착하고 약물을 흡인합니다. 펌프를 똑바로 세우고 펌프 상단의 구멍에 주사기를 삽입한 다음 기포가 생기지 않도록 주의하면서 천천히 약물을 주입합니다(그림 2D 참조). 액체가 개구부 밖으로 흘러나오면 주사기를 천천히 빼냅니다.
3. 유량 조절기를 구부리거나 찌그러뜨리지 않도록 주의하면서 가위나 펜치로 유량 조절기에서 흰색 플랜지를 제거합니다. 그런 다음 유량 감속기를 펌프에 삽입합니다(그림 2E). 삼투압 펌프에 기포가 있는지 확인하려면 충전 전후에 삼투압 펌프의 무게를 별도로 측정하십시오.
4. 동물의 크기에 따라 카테터를 일정 길이로 다듬습니다(무게가 약 25g인 P56 마우스의 경우 25-25mm 카테터). 카테터를 뇌 주입 캐뉼라에 부착합니다.
5. 공기를 유입하지 않고 주사기를 사용하여 카테터에 약물을 채웁니다(그림 2F).
6. 카테터를 흐름 조절기에 연결합니다. 부착 후 카테터가 노출된 유동 조절제의 약 4mm를 덮고 있는지 확인합니다(그림 2G).
7. 삼투압 펌프가 이식 후 즉시 작동할 수 있도록 하려면 채워진 펌프를 멸균 0.9% 식염수 또는 PBS에 37°C에서 최소 4-6시간 동안(바람직하게는 하룻밤까지 연장) 조직 환경과 동일한 삼투압을 갖는 용액으로 펌프 표면의 반투막을 미리 적십니다(그림 2H).
8. 펌프에 적재된 모든 용액은 멸균되어야 합니다. ALZET 펌프는 멸균 용량의 코발트-60에 노출되어 멸균 상태로 공급됩니다. 그러나 외부 오염이 발생한 경우 펌프 표면을 이소프로필 알코올(물 중 70%)으로 닦아 청소할 수 있습니다.

3. 삼투압 펌프 이식

뇌

1. 량 탈수초화 모델 확립 후 3일 동안 기다립니다. 소동물 마취 시스템을 켭니다. 가위, 핀셋, 지혈 펜치를 소독하고 75% 알코올 용액에 담그십시오. 수술 부위에 멸균 시트를 놓습니다.
2. 마우스를 마취하고 정위 고정 장치에 다시 고정합니다. 건조함을 방지하기 위해 안구 표면을 눈 연고로 덮으십시오.
3. 원래 상처를 75% 알코올로 소독합니다. 이전에 꿰매었던 수술 절개부를 열고(그림 3A) 절개를 견갑골까지 확장합니다(그림 3B).
4. 견갑골에서 지혈 펜치나 핀셋으로 피하 결합 조직에서 피부를 분리하여 구멍을 엽니다(그림 3C). 삼투압 펌프를 캐비티에 넣습니다(그림 3D, E).
5. 면봉으로 탈수초화 모델을 설정할 때 생성된 두개골 표면의 핀홀을 부드럽게 닦고 노출시킵니다(1.8단계 참조). 이 핀홀을 통해 뇌 주입 캐뉼라를 수직으로 삽입하고 조직 접착제로 두개골에 빠르게 고정합니다(그림 3F).
가
6. 위로 뇌 주입 캐뉼라 위의 탈착식 탭을 제거합니다(그림 3G, H). 또는 이 과정에서 흔들리지 않도록 캐뉼라를 삽입하기 전에 먼저 탭을 제거하십시오.
7. 절개 부위를 꿰매거나 조직 접착제로 부착합니다(그림 3I).
8. 수술 후에는 체온 강하를 방지하기 위해 마우스를 가열 패드 위에 올려 놓으십시오. 통증을 완화하기 위해 24시간마다 5mg/kg 카프로펜을 피하 주사합니다. 상처가 제대로 치유되도록 매일 절개 부위에 에리스로마이신 연고를 바르십시오. 동물을 우리에 혼자 넣고 완전히 회복될 때까지 촉촉한 음식을 먹입니다.

결과

그림 1: 리솔레시틴 유도 탈수초화 마우스 모델의 확립. (A) 정위 고정 장치에 마우스를 고정합니다. (B) 1cm 중간 시상 절개를 열어 두개골을 노출시킵니다. (C) 두개골 봉합사를 시각화합니다. (D) Bregma 점에서 x, y 및 z 좌표를 0으로 재설정합니다. (E) 주사기를 주사 부위로 옮...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마취 공기 펌프	RWD	R510-29	E05818-006
뇌 주입 키트 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	24시간마다 5mg/kg
리스로마이신 눈 연고	기술	YCKJ-RJ-024780	취 중 안구 표면 덮
에리스로마이신 연고	pythonbio	RG180
가스 배출 장치	RWD	R546W	E05518-002
L-α-리소포스파티딜콜린	시그마	L0906	멸균 PBS
마이크로리터 주사기	해밀턴	65460-05	주사기 시리즈: 1700, 10 μL, 33 게이지
미세 삼투압 펌프 모델 1002	ALZET	4317	시간당 0.25 μL, 14일
PBS(pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
펜토바르비탈 나트륨	상하이 Civi	CAS 번호: 57-33-0	안락사용 150-200 mg/kg 복강내 주사
동물 마취기	RWD	R520IE	E05807-006 M
정위 고정 장비	RWD	E06382
STERI 250 살균기	Keller	31101	수술 기구의 신속한 살균
수술용 봉합사	상하이 jinhuan	F504	5-0
사기 바늘(1mL)	상하이 KDL	6930197811018	26게이지(0.45mm x 16mm)
약물 및 용매	테스트실험 의존	N/A
Thermostar 항온열 모니터링 시스템	RWD	69026	마취 중 체온 유지
Vetbond 조직 접착제	3M	1469SB	뇌 주입 캐뉼라를 고정하고 피부 절개 부위를 부착합니다.

에 마기 로 1%로 용해 소 주