쥐 중추신경계에 대한 테스트 화합물의 척수강내 전달

초록

출처: Chen, Y., et al. 쥐 중추신경계에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 척수강내 전달. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 쥐 모델의 요추 척추에 이식된 카테터를 통해 테스트 화합물을 뇌척수액(CSF)으로 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 화합물은 CSF를 따라 뇌와 척수로 순환하고 뉴런으로 들어가 치료 가능성을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술

1. 50mL 원추형 튜브로 지지되는 쥐를 사용하여 골반 위의 근육 사이에 있는 두 개의 자연 구덩이를 식별합니다(그림 1A의 화살표). 한 손으로 구덩이를 잡고 다른 손으로 척추를 꼬리에서 방향으로 부드럽게 누르고 느끼며 척추뼈 사이의 첫 번째 주요 움푹 들어간 부분을 찾는데, 이것이 천골 1(S1)과 요추 6(L6) 척추 사이의 추간 공간입니다(그림 1B).
2. 주둥이쪽으로 약간 움직여 다음 움푹 들어간 부분, 요추 5(L5)와 L6 척추 사이의 추간 공간, 주사 부위(그림 1A의 *)를 식별합니다. 메스를 사용하여 주사 부위가 절개 부위의 중앙에 오도록 주둥이에서 꼬리까지 정중선을 따라 피부에 길이가 2cm 이하의 절개를 합니다(그림 1A의 점선).
3. 해부 가위를 사용하여 결합 조직을 해부하여 근육층을 시각화합니다. 그런 다음 L6 요추의 등쪽 척추 돌기 바로 옆쪽에 있는 근육낭에 1cm 절개를 합니다.
   참고: 이 시점에서 L6 요추의 뼈를 시각화할 수 있습니다.
4. 가이드 캐뉼라-바늘 어셈블리를 제6 요추 앞쪽 근처에 배치하고 바늘 끝이 척추관을 관통하도록 6번째 척추 앞쪽을 따라 추간 공간으로 밀어 넣습니다. 가이드 캐뉼라를 바늘을 따라 제자리에 밀어 넣고 23-G 바늘을 제거하고 가이드 캐뉼라만 제자리에 둡니다.
   참고: 바늘을 삽입하기 전에 무딘 겸자를 사용하여 L6 요추의 등쪽 돌기를 찾는 것이 도움이 됩니다. 일반적으로 뇌척수액(CSF)액이 바늘 허브로 들어가는 것을 볼 수 있습니다(이 액체는 약간의 피가 섞일 수 있지만 이것이 해를 끼쳤거나 바늘이 올바르게 배치되지 않았음을 나타내지는 않습니다). 저자는 이 절차 중에 많은 양의 혈액이나 심한 출혈을 못했습니다. 둘 중 하나가 발생하면 수의사에게 연락하여 적절한 치료법과 동물을 안락사시켜야 하는지 여부를 결정해야 합니다.
5. 카테터 와이어 어셈블리를 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 카테터 와이어 어셈블리를 척추관에 대해 약 45° 각도로 기울이고 끝을 척추관에 약 0.3cm 밀어 넣습니다.
6. 가이드 캐뉼라를 제거하고 탐침 와이어가 있는 카테터를 그대로 둡니다. 그림 2Bvi와 같이 카테터의 척수강내 끝에서 약 2.5cm 떨어진 탐침 와이어를 제거하고 2cm 표시가 근관 입구(근육 바로 아래에서 볼 수 있음)에 있을 때까지 카테터를 척추관으로 전진시킵니다.
   참고: 삽입된 카테터는 주둥이쪽으로 지주막하 공간으로 확장되어야 합니다. 성공적인 배치는 카테터가 해당 공간에서 자유롭게 움직일 수 있도록 해야 합니다.
7. 탐침 와이어를 완전히 빼내면 이식된 카테터로 CSF가 들어가는 것을 볼 수 있습니다.
8. 30G 바늘 끝을 통해 이식된 카테터의 원위 끝에 전달 카테터 어셈블리를 연결합니다(그림 2Bv, vi).
9. 60μL의 멸균 식염수를 100μL 주사기(플러싱 주사기)에 넣습니다. 30μL의 시험 화합물(예: 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 ASO 용액)을 두 번째 주사기(주입 주사기)에 적재합니다.
10. 플러싱 주사기(식염수가 포함됨)를 전달 카테터 어셈블리의 튜브 어댑터 끝에 연결합니다(그림 2Bv). 20μL의 멸균 식염수를 척수강내 공간에 주입합니다(주사 전 플러싱).
11. 주입 주사기(테스트 화합물이 로드됨)를 전달 카테터 어셈블리의 튜브 어댑터 끝에 연결합니다(그림 2Bv). 30초에 걸쳐 척수강내 공간에 30μL의 테스트 화합물을 주입합니다.
    참고: ASO의 일상적인 주입량은 척수와 피질에서 우수한 녹다운을 달성하기 위해 30μL입니다. 주입량이 화합물 분포에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었지만 다른 주입량은 테스트되지 않았습니다. 다른 화합물이나 부피를 사용하는 경우 안전성과 유효성을 경험적으로 결정해야 합니다.
12. 1.10단계를 반복하고 다른 40μL의 멸균 식염수로 카테터를 세척합니다(주사 후 세척). 그런 다음 이식된 카테터에서 전달 카테터 어셈블리를 분리합니다.
    참고: 주사 전 및 사후 플러시는 화합물의 국소 격리를 줄이고 구조로의 분포를 개선하는 것으로 생각됩니다.
13. 이식된 카테터를 무균 절단하고 열 밀봉하려면 한 쌍의 멸균 해부 겸자를 비드 멸균기에 매우 뜨거워질 때까지 넣은 다음 집게의 뜨거운 끝으로 튜브를 고정합니다.
    참고: 이 동작은 카테터를 녹입니다. 따라서 튜브의 구멍이 무너지고 모든 면이 서로 달라붙어 튜브를 무균 방식으로 밀봉합니다. 그런 다음 피하 공간에 배치합니다.
14. 흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 나머지 열 밀봉 카테터를 결합 조직에 고정합니다. 그런 다음 비흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 고정된 열 밀봉 카테터 위의 피부를 봉합합니다.
    참고: 상처 클립은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜의 승인을 받은 대로 사용할 수도 있습니다. 이 기술은 반복 주사와 호환되지만 우리 손에 한 번만 주사하는 데 사용되었습니다. 반복 주사의 타당성은 IACUC의 승인을 받아 경험적으로 평가되어야 합니다.
15. 거즈와 식염수를 사용하여 피부의 혈액을 씻어내고 동물이 움직일 때까지 가열된 인큐베이터에서 마취에서 회복되도록 한 다음 집 케이지로 되돌립니다(카이지당 쥐 2마리).
    참고: 같은 날 여러 마리의 쥐에게 수술을 수행할 때 물을 사용하여 도구를 청소하여 혈액을 제거하고 가열된 건식 비드 멸균기를 사용하여 다시 멸균합니다(최소 20초 동안, 식힐 시간) 동물 사이. 5마리의 동물마다 새로운 악기 세트가 사용됩니다.
16. IACUC 프로토콜에 따라 수술 후 최소 3일 동안 매일 동물을 모니터링하고 수술 후 매주 계속 모니터링합니다.

결과

그림 1: 주사 부위 및 절개선 식별. (A) 쥐의 복부를 50mL 원추형 튜브로 지지하면 골반 위의 근육 사이에 있는 두 개의 구덩이를 쉽게 볼 수 있습니다(화살표). (B) 한 손으로 구덩이를 잡고 다른 손으로 척추를 부드럽게 누르고 느끼며 L5와 L6 척추 사이의 추간 공간, 즉 주사 부위(패널 A의 *)를 찾습니다. 패널 A의 점선은 주사 부위가 중앙에 있는 절개선을 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 의료용 PE 튜브	BD	폴리에틸렌 튜브 PE50, BD 0.023(	10피트, Fischer Scientific 22-204008) 또는 427401(100피트, Fischer Scientific 14-170-12P)
의료용 PE 튜브	BD	폴리에틸렌 튜브 PE10, 직경 0.011인치	BD 427410(10피트, Fischer Scientific 14-170-11B) 또는 4274011(100피트, Fischer Scientific 14-170-12B)
PrecisionGlide 일회용 바늘 30G	BD		BD
가이드 캐뉼라	BD	19G x 1 WT(1.1mm x 25mm) 바늘	BD 305186
해밀턴 주사기 100 ul	해밀턴 회사	해밀턴 주사기 100 ul
비드 멸균기	세 과학 도구		살균기 모델 번호 FST 250
포비돈 스크럽	PDI		S48050
식염수	백스터	염화나트륨 0.9% 정맥 주입 BP 50ml	FE1306G
	깃털	일회용 메스	10호
동물 가열 패드	K&H 제조		모델 번호 1060
탐침 와이어	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
수술용 수건 드레이프	Dynarex		4410
수술용 가위 및 겸자	FST 및 Fisher Scientific
봉합사	Ethicon		4-0 또는 5-0
이 절차를
징 카테터 시스템	SAI 주입 시스템		RIDC-01
가이드 캐뉼라	SAI 주입 시스템		RIDC-GCA
내부 카테터	SAI 주입 시스템		RIDC-INC
탐침 와이어	SAI 주입 시스템		RIDC-STY

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