포도당이 결핍된 신경모세포종 세포에서 대기압 혈장 치료 평가

초록

출처: Yan, X., et. al., SH-SY5Y 세포의 포도당 결핍으로 인한 손상에 대한 신경 보호제로서 대기압 플라즈마 제트의 새로운 적용. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 산화 스트레스를 조절하고 세포 생존력을 향상시켜 포도당이 결핍된 신경모세포종 세포에서 저선량 대기압 혈장 치료의 신경 보호 활성을 보여줍니다.

프로토콜

1. SH-SY5Y의 APPJ(Atmospheric Pressure Plasma Jet) 처리

1. 석영 튜브의 노즐과 96웰 플레이트를 놓을 플랫폼 사이의 거리를 3cm로 조정합니다. 빔이 배양 배지 표면에 닿을 수 있는지 확인하십시오.
   참고: 거리는 플레이트 바닥에서 측정되지 않습니다. 먼저 석영 튜브의 노즐과 96웰 플레이트를 배치하는 데 사용되는 플랫폼 사이의 3cm로 조정됩니다.
2. APPJ(Atmospheric Pressure Plasma Jet) 처리 전에 대조군 웰을 제외한 각 웰의 배양 배지를 포도당 배지가 없는 RPMI 1640으로 변경합니다.
3. 플레이트를 APPJ 노즐 아래에 놓고 제트가 각 웰에 수직으로 분사될 수 있는지 확인합니다.
4. 0초, 1초, 2초, 4초, 8초 및 12초 동안 APPJ로 별도의 웰에서 세포를 처리합니다.
   참고: APPJ는 헬륨을 이온화하여 생성됩니다(그림 1). 포도당 결핍으로 손상된 세포는 세포에 대한 헬륨의 영향을 제거하기 위해 4초 및 8초 헬륨 흐름으로 처리됩니다. 모든 치료는 3중으로 수행해야 합니다.

2. 세포 생존율 분석

참고: 이 단계에서 배지를 변경하지 마십시오.

1. APPJ 처리 후, 세포 인큐베이터에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
2. 각 웰에 10 μL의 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 용액을 추가합니다.
3. 세포를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
   참고: SH-SY5Y 세포주는 포도당 결핍 조건에 민감합니다. 세포 생존력은 포도당 결핍 1시간 후 거의 50%로 감소하며, 이는 약력학 연구를 위한 최적의 세포 생존력 조건입니다. CCK-8은 세포에 대한 세포독성이 없으며, 세포 생존력을 확인하기 위해 APPJ 처리 후 포도당 결핍 조건에서 세포를 CCK-8 시약과 함께 추가로 4시간 동안 배양합니다. 8시간의 포도당 결핍 및 APPJ 치료 후, 포도당 결핍의 장기간으로 인해 SH-SY5Y 세포가 심각하게 손상되었기 때문에 APPJ의 보호 효과가 현저히 감소했습니다. 포도당 결핍 24시간 후 살아있는 세포의 증거는 없었습니다.
4. 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정합니다.

결과

그림 1: APPJ(대기압 플라즈마 제트) 배출에서 일반적인 RNS(반응성 질소종) 및 ROS(활성 산소종) 반응.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SH-SY5Y 세포주	중국 유형 배양 컬렉션 센터	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 배지	Thermo Scientific	21875091	4°C에서 보관
RPMI 1640 배지 포도당 없음	Thermo 과학	11879020	4°C에서 보관
아지 태아 혈청	Thermo Scientific	16000044	-20°C에서 보관
96웰 플레이트	코닝	3599
세포 계수 키트-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	4°C에서 보관
마이크로플레이트 리더	Tecan	M200 Pro	450nm에서 흡광도 측정용
고전압 전력 증폭기	Trek	PD06087	전력 증폭용
신호 발생기	MaZe Electronics Science & Technology	AT30120	특정 신호 제공용
전압 프로브	Tektronix	P6015A	고전압
디지털 오실로스코프	Tektronix	DPO4104B	신호 표시용

송 기능 고 감지용