포지셔닝 장치를 사용하여 마우스 뇌에 siRNA의 비강내 전달

초록

출처: Ullah, I., et.al. 중추신경계에 비강내 siRNA를 전달하는 동안 마우스를 배치하기 위한 포지셔닝 장치. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 특수 포지셔닝 장치를 사용하여 뉴런 표적 펩타이드-siRNA 복합체를 마우스 뇌에 전달하기 위한 정밀한 비강내 투여 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 폐 배액을 방지하면서 siRNA 흡입을 최적화하기 위해 머리를 아래로 향하게 하고 앞으로 고정합니다. 표적 펩타이드는 뉴런에서 수용체 매개 흡수를 촉진하여 뇌에서 표적 siRNA 전달 및 유전자 침묵을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 위치 지정

1. 수술 평면을 유지하기 위해 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음)로 마취 수준을 평가합니다.

2. 필요한 모든 시약에 편리하게 접근할 수 있도록 포지셔닝 장치를 적절한 거리와 높이에 배치합니다.

3. 쥐가 적절하게 마취되면 엄지와 검지로 각 쥐의 목덜미를 부드럽게 들어 올려 지정된 의자 위에 놓습니다.

4. 이 단계에서는 의자에 마우스를 올바르게 배치하는 것이 매우 중요합니다. 마우스 등받이를 의자의 등받이와 평행하게 놓고 의자 시트와 90° 각도로 눕힙니다. 그림 1B와 같이 마우스에서 손을 떼고 동물이 밀거나 누르지 않고 머리를 아래로 아래로 향하게 자연스럽게 눕도록 합니다. 동물이 이 편안한 자세를 취하는 동안 마우스의 앞다리가 마우스에 불편함 없이 자연스러운 지지력을 제공하는지 확인하십시오.

5. 쥐가 올바른 위치에 있으면 의자 벨트로 쥐를 묶고 즉시 비강내 접종을 시작합니다.

2. 비강내(IN) 전달

참고: 이 프로토콜은 마우스 포지셔닝 장치를 사용하여 RVG9R:siRNA 복합체의 IN 전달을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 최대 20-30μL의 용액을 2μL 방울로 각 마우스에 쉽게 투여할 수 있습니다. 이 부피는 0.032cm3인 마우스의 비강보다 낮기 때문에 치명적인 콧구멍 폐쇄나 질식을 초래하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하면 장치당 최소 4마리의 마우스와 최대 8마리의 마우스를 동시에 접종할 수 있어 시간이 최적화되고 변동성이 줄어듭니다.

1. 10μL 마이크로피펫을 가져다가 2μL로 조정합니다.

2. 마이크로피펫에 RVG9R:siRNA 복합체 용액 2μL(예: 전달 실험을 위해 104μg의 RVG9R과 복합된 5.2μg의 siCy5, 침묵 실험을 위해 270μg의 RVG9R과 복합된 13.5μg의 siSOD1, 5% 포도당을 함유한 PBS 25μL의 최종 부피에 넣습니다.

3. 주로 사용하는 손으로 피펫을 잡은 상태에서 벤치 상단에 팔꿈치를 올려 위치를 조정합니다. 투여하는 동안 통제되지 않은 움직임을 피하기 위해 다른 손으로 피펫을 잡고 있는 손을 지지합니다.

4. 마우스가 물방울을 직접 흡입할 수 있도록 한쪽 콧구멍에 ~2μL 방울을 매우 가깝게 놓습니다(그림 1B 참조). 작은 방울이 쉽게 형성되지 않으면 피펫 팁을 새 것으로 교체하고 작업을 반복하십시오. 스톱워치를 사용하여 접종 사이의 시간 간격을 확인하십시오.

5. 이 장치를 사용하면 한 번에 최소 4마리의 쥐를 치료할 수 있습니다. 다른 그룹의 마우스가 단계 2.4를 반복해야 하는 경우, 장치에 한 번에 최대 8마리의 마우스를 수용할 수 있도록 4개의 의자가 있는 첫 번째 막대 위 또는 아래에 4개의 의자가 있는 또 다른 막대를 설정합니다.

6. 첫 번째 접종 후 3-4분 후에 다른 쪽 콧구멍으로 2.4단계를 반복합니다. 이 시간 간격은 마우스가 첫 번째 용량의 흡입을 완료하고 정상적인 호흡을 회복하기에 충분합니다. 마우스의 콧구멍에서 우발적으로 코를 골어 흡입된 용액 한 방울이 빠져나가면 추가로 2μL의 용액을 재접종합니다.

7. 20-30μL 용량이 완료될 때까지 대체 콧구멍으로 전체 과정을 반복합니다. 전체 접종 절차를 완료하는 데 ~30-45분이 소요됩니다.

8. 쥐를 지정된 새장으로 되돌리기 전에 생쥐의 눈에 젖은 연고를 바르십시오.
참고: 쥐가 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오.

결과

그림

1: 포지셔닝 장치를 사용한 IN 접종 절차의 사진 프레젠테이션. (A) IN 접종에 필요한 실험 장비. (B) 장치에 앉은 머리 아래와 앞으로 자세의 동물(왼쪽)과 IN 접종을 위한 2μL 액적의 침착(오른쪽).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 균주
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8주 생후, 20-30g
펩타이드
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRRR
소프트웨어, 알고리즘 및 장치
마우스 포지셔닝 장치	Signet Biotech	N/A
올리고뉴클레오티드 및 프라이머
siSOD1	ST Pharm	N/A	센스: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
프라이머	ST Pharm	N/A	F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'