분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스 눈은 인간의 안과 질환의 병진 연구의 중요한 유전 모델입니다. 이러한 황반 변성, photoreceptor 변성, 백내장, 녹내장, retinoblastoma, 그리고 당뇨병 성 망막증과 같은 인간에 실명을 야기하는 안구 질환을 치료는 1-5 대부분의 유전자 변형과 녹아웃 마우스가 아닌 안과 질환을 연구하기 위해 실험실에 의해 생성되었습니다. 유전자 변형 마우스에 recapitulated하지만, 한 장기 시스템 사이의 유전 절약은 동일한 유전자의 많은도 안구 개발과 질병에 역할을 할 수 있습니다 제안합니다. 따라서,이 마우스는 눈에 새로운 유전자형 - 표현형의 상관 관계를 발견하기위한 중요한 자원을 나타냅니다. 이 마우스는 전 세계에 흩어져 있기 때문에, 취득, 유지 관리 및 효율적 비용 효율적인 방법으로 표현형을하기가 어렵습니다. 따라서, 대부분의 높은 처리량 안과 phenotyping 화면은 라이브 쥐에 눈을 검토하기 위해 안과 전문 현장에서 필요로 몇 가지 위치로 제한됩니다. 6-9는 우리 연구실에서 개발 한 대체 접근 방식은 유전자 변형 마우스 눈 크고 작은 규모의 설문 조사에서 사용할 수있는 원격 조직 - 취득하는 방법입니다. 비디오 기반의 수술 기술 이전, 조직 고정 및 배송을위한 표준화 된 절차는 실험실 돌연변이 동물로부터 전체 눈을 수집하고 분자 및 형태학 phenotyping에 보내 할 수 있습니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 원격 phenotyping 분석을 위해 떼어 낸 및 재관류 모두 고정 마우스 눈을 명백히하다하고 전송하는 기술을 제시한다.
프로토콜
1. 무딘 절개 : 고정되지 않은 표본에서 마우스 눈의 핵의 제거
- 노출과 뒤쪽 세계 (안구) 표면에 대한 액세스를 개선하기 위해 눈꺼풀를 분열.
- 궤도의 (이하) 세계 (눈 소켓) 뒤에 곡선 드레스 forcep를 놓습니다. Mahajan Sharptip 드레싱 forcep은 (재료 및 시약 표 참조)이 단계를 쉽게하기 위해 뾰족한 팁을 사용자 정의 악기입니다.
- forcep을 닫고 세계를 쥐어 피하려면 조심하면서 전 세계 뒤에 궤도 결합 조직과 시신경을 파악.
- 부드럽게 위쪽으로 forcep을 뽑아 궤도에서 눈알을 뽑아 내다. 흰색 스레드와 같은 조직은 시신경입니다.
- PBS의 눈을 놓으십시오. 30 게이지 바늘을 사용하여, 하나의 구멍이 안구에 바늘 1~2밀리미터를 삽입하여 limbus에 바로 뒤쪽 상처를합니다. 이 안구 조직을 침투하기가 달리없는 등 글 루타 알데히드 등의 fixatives는,,, 실내 직접 수행 할 수 있습니다적이있는 눈. 이 정착액 등 paraformaldehyde 또는 알코올 등, 관심 안구 조직에 diffusing 할 경우이 찔린 상처를 만들 필요하지 않을 수 있습니다.
- 즉시 침지 고정 용 정착액으로 전체 눈을 놓습니다.
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토론
대부분의 유전자 변형 마우스는 눈을 검사하지 않는 실험실에 존재합니다. 우리 비디오 기술은 눈 작은 경험이있는 실험실에서 조직 획득을 최적화 할 수 원격 수술 기술 이전을위한 간단한 표준화 된 방법을 보여줍니다. 이 비디오 기술은 의미있는 비교 phenotypic와 분자 연구를 방지 비 표준화 조직 수집 및 고정 방법에 의한 전문 사이트 제한된 수의를 사용하는 것입니다 높은 처리량 phenotyping에 주요 함정을 극복하는 데 도움이됩니다. 새로운 원격 실험실과 기술자와 품질 관리를 설정하고 유지하기 위해, 그것은 시작과 정기적으로 연구를 통해 야생 형 눈을 포함하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 여러 genotypes에서 여러 눈 등 각각의 눈에 고유 한 식별 번호를 할당 할 수있는 웹 기반 시스템으로, 전송 때 추적 시스템이 중요하다는 것을 발견했다. 높은 수준의 고정 및 후속 조직 섹션을 얻을 수 있지만재관류 - 고정 동물, 우리는 고정되지 않은 동물로부터 enucleated 표본은 대부분의 형태학 및 분자 연구를위한 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
Bartly J. Mondino MD, 줄스 스타 인 안구 연구소, UCLA의 이사;, 그리고 라미 네즈 - 솔리스, 재키 선배 화이트와 Sanger 연구소, 웰컴 트러스트 게놈 캠퍼스에서 쟌 Estabel 실명 방지를위한 연구. 이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 구부러진 드레싱 Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip 드레싱 forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| 곡선 Westcott의 가위 | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15 ° BD 비버 Microsurgical 블레이드 | Becton - 디킨슨 | 374881 | |
| 0.22 미세 Castroviejo Suturing의 포셉 | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri 포셉 | Storz Ophthalmics | 132분의 2 | |
| 30 게이지 바늘 | Becton - 디킨슨 | 305128 | |
| 바이오 해저드 메일 서버 | 어부 | 03-523-4 | |
| Parafilm | 어부 | 13-374-10 | |
| 유리 섬광 튜브 | 휘튼 | 4500413033 | |
| PBS, pH를 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16 % Paraformaldehyde | 전자 현미경 과학 | 15,700 | |
| 0.1M 나트륨 인산염 버퍼에 2.5 %의 Paraformaldehyde / 2.5 %의 글 루타 알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15700 및 16300 | 실험실에서 혼합 |
| 50 % 글 루타 알데히드 | 전자 현미경 과학 | 16,300 | |
| 0.25 % Formvar | 전자 현미경 과학 | 15,810 | |
| 순경슬롯 그리드 당 | 전자 현미경 과학 | M2010-CR | |
| 4 % 오스뮴의 Tetroxide | 전자 현미경 과학 | 19,140 | |
| 안티 SOD3 항체 | Abcam | Ab21974 | |
| 염소 안티 - 토끼 알렉사 형석 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr의 삽입 수지 | 전자 현미경 과학 | 14,300 |
참고문헌
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold....
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재인쇄 및 허가
