재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질의 분리 및 정제

초록

출처: Jain, RW, et al. 실험적 자가면역 뇌척수염 연구를 위한 마우스 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질의 간단하고 효율적인 생산 및 정제. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 연구에 사용되는 재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)인 MOGtag의 분리 및 정제를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 정제된 MOGtag를 얻기 위한 박테리아 용해, 초음파 처리, 원심분리 및 니켈 친화성 크로마토그래피가 포함됩니다. 이 단백질은 다발성 경화증 모델에서 B 세포 매개 자가면역 연구를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. MOGtag 단백질 수확

참고: 이 단계에서 박테리아는 많은 양의 MOGtag 단백질을 생산하게 됩니다. MOGtag를 수확하기 위해 박테리아는 먼저 Triton X-100 완충액에서 용해된 다음 초음파 처리를 수행합니다. 그런 다음 MOGtag는 봉입체에서 방출되고 이미다졸과 구아니딘으로 변성되어 MOGtag 단백질을 포함하는 조단백질 용액이 생성됩니다.

1. 하룻밤 배양 중 하나에서 1ml 분취량 1개를 취하여 1.5ml 미세 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 세포를 16,000 x g 1분 동안 펠릿화하고 상청액을 제거합니다. 튜브에 TO/N(유도 후)으로 라벨을 붙인 다음 향후 SDS 페이지 분석을 위해 박테리아 펠릿을 -20°C 냉동고에 넣습니다(그림 2).
2. 고속 원심분리와 호환되는 250ml 병에 배양균을 고르게 분배하고 이 시점부터 얼음 위에 보관합니다. 박테리아 세포를 22,000 x g으로 4°C에서 15분 동안 펠릿화합니다.
3. 상청액을 버리십시오. 박테리아 펠릿을 -20°C에서 보관하거나 1.4단계를 계속합니다.
4. 60 μl의 Triton X-100 및 120 μl의 50 mg/ml 암탉 계란 리소자임 원액을 60 mL의 PBS에 첨가하여 용해 완충액(0.1 mg/ml 암탉 계란 리소자임, 인산염 완충 식염수(PBS)의 0.1% Triton-X(v/v))을 준비합니다.
5. 1.3단계의 모든 박테리아 펠릿을 총 30ml의 용해 완충액에 재현탁하고 결합합니다. 이 부피를 고속 원심분리가 가능한 둥근 바닥 50ml 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 30°C 수조에 30분 동안 넣습니다. 배양 시간 동안 튜브를 두 번 흔들어 세포를 재현탁시킵니다.
6. 배양 후, 튜브를 얼음 위로 옮기고 용액을 20kHz, 진폭 70 %, 3 초 동안 펄스 켜기, 3 초 동안 펄스 끄기, 라운드 당 5 펄스로 초음파 처리합니다. 총 6 라운드 동안 용액을 초음파 처리하고 라운드 사이에 용액이 얼음 위에서 식도록 합니다.
7. 용액을 24,000 x g으로 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 1.5-1.7단계를 한 번 반복합니다. 펠릿을 -20°C에서 보관하거나 1.8단계를 계속합니다.
8. 100ml 비커에 0.8766g의 NaCl, 0.09456g의 Tris-HCl 및 0.01021g의 이미다졸을 첨가하여 완충액 A(500mM NaCl(염화나트륨), 20mM Tris-HCl(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염산염), 5mM 이미다졸, pH 7.9)을 제조합니다. 부피가 28ml에 도달할 때까지 물을 넣은 다음 용액의 pH를 7.9로 조정합니다. 그런 다음 용액을 100ml 눈금 실린더에 옮기고 부피가 30ml가 될 때까지 물을 추가합니다.
9. 1.7단계의 펠릿을 30ml의 완충액 A에 재현탁하고 이 용액을 4°C에서 3시간 동안 배양합니다. 이 시간 동안 구아니딘-HCl 17.2g의 무게를 측정합니다.
10. 1.6 단계와 동일한 설정을 사용하여 얼음 위에서 용액을 초음파 처리합니다. 그런 다음 용액에 17.2g의 구아니딘-HCl을 첨가합니다. MOGtag 단백질을 가용화하기 위해 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
11. 용액을 24,000 x g으로 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 수집하고 단백질 정제가 될 때까지 상청액을 4°C에서 보관합니다.

2. 단백질 정제

참고: 다음 단계에서 MOGtag 단백질은 하전된 니켈 수지(His-tag를 통해)에 대한 4차례의 흡수 및 용출을 통해 정제됩니다.

1. 다음 완충액을 만듭니다.
   1. 완충액 B(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 5mM 이미다졸, 6M 구아니딘-HCl, pH 7.9)를 준비합니다. 500ml 비커에 NaCl 5.844g, Tris-HCl 0.6304g, 이미다졸 0.0681g 및 구아니딘-HCl 114.64g을 첨가합니다. 그런 다음 190ml가 될 때까지 물을 넣고 pH를 7.9로 조절합니다. 용액을 250ml 눈금 실린더에 옮기고 부피가 200ml가 될 때까지 물을 추가합니다.
   2. 용출 완충액(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 0.5M 이미다졸, 6M 구아니딘-HCl, pH 7.9)을 준비합니다. 500mL 비커에 NaCl 5.844g, Tris-HCl 0.6304g, 이미다졸 6.808g 및 구아니딘-HCl 114.64g을 첨가합니다. 190ml가 될 때까지 물을 넣고 pH를 7.9로 조절합니다. 용액을 250ml 눈금 실린더에 옮기고 부피가 200ml가 될 때까지 물을 추가합니다.
   3. 스트립 완충액(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 100mM EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산), pH 7.9)을 준비합니다. 500mL 비커에 NaCl 5.844g, Tris-HCl 0.6304g, 500mM EDTA 40ml를 첨가합니다. 190mL가 될 때까지 물을 넣고 pH를 7.9로 조정합니다. 용액을 250ml 눈금 실린더에 옮기고 부피가 200ml가 될 때까지 물을 추가합니다.
   4. 충전 완충액(0.1M 황산니켈)을 준비합니다. 5.257ml 비커에 황산니켈 500g을 넣고 190ml가 될 때까지 물을 추가합니다(주의, 황산니켈이 물에 용해될 때까지 흄 후드 외부에서 황산니켈을 취급하지 마십시오). 황산니켈이 용해되면 용액을 250ml 눈금 실린더에 옮기고 부피가 200ml에 도달할 때까지 물을 추가합니다.
2. 4,500 x g 이상의 원심력을 견딜 수 있는 두 개의 원뿔형 50ml 원심분리기 튜브 사이에 니켈 수지 10ml를 쪼개십시오(각 튜브에 5ml).
3. 니켈 수지를 충전하고 평형을 유지합니다.
   1. 수지가 들어 있는 각 튜브에 물 40ml를 추가하여 수지를 세척합니다. 튜브를 로커 위에 수평으로 놓고 4°C에서 5분 동안 교반합니다. 완료되면 튜브를 4,500 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다.
   2. 펠릿을 방해하지 않도록 피펫팅하여 상청액을 버립니다. 각 튜브에 40ml의 충전 완충액을 추가합니다. 튜브를 로커에 옮기고 4°C에서 15분 동안 교반합니다. 완료되면 튜브를 4,500 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다.
   3. 상청액을 버린 다음 40ml의 완충액 B를 튜브에 추가합니다. 튜브를 로커로 옮기고 4°C에서 5분 동안 교반합니다. 완료되면 튜브를 4,500 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리한 다음 상청액을 버립니다.
4. 선택 사항: 1.11단계에서 수집된 가용화 단백질 150μl를 취하여 1.5ml 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 사전 배양으로 라벨을 붙이고 향후 SDS(도데실 황산나트륨) 페이지 분석을 위해 -20°C에서 동결합니다(그림 2, Crude MOGtag).
5. MOGtag 단백질 정제:
   1. 1.11단계(~40ml, 2.4단계에서 제거한 작은 샘플 제외)에서 가용화된 단백질의 전체 부피를 2.3단계에서 니켈 수지가 포함된 첫 번째 튜브(그림 1, 튜브 1)로 옮기고 혼합한 다음 4°C에서 로커에 수평으로 1시간 동안 놓습니다.
   2. 튜브를 4,500 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다. 완료되면 상청액을 니켈 수지의 두 번째 튜브(그림 1, 튜브 2)로 옮기고 이전 단계에서 설명한 대로 배양합니다. 그동안 튜브 3을 사용하여 아래 6-1단계를 계속합니다.
   3. 용출 완충액 40ml에 튜브 1에 니켈 수지를 재현탁하고 튜브를 4°C에서 로커에 수평으로 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 4,500 x g으로 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다.
   4. 용출된 MOGtag 단백질을 함유한 상청액을 '정제된 MOGtag 단백질'이라고 표시된 250ml 병에 옮기고 이 병을 4°C에서 보관합니다. 각 용출 단계에서 생성된 상청액을 이 병에 모으십시오.
   5. 니켈 수지에 스트립 완충액 40ml를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 로커에 수평으로 놓습니다.
   6. 튜브를 4,500 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 다음 2.3단계에 나열된 대로 니켈 수지를 재충전합니다.
   7. 완료되면 2.5단계에 나열된 대로 두 번째 튜브를 사용하여 앞으로 나아갑니다. 단계 1.11에서 가용화된 단백질을 하전된 니켈 수지로 총 4회 흡수하고 용출하면 대부분의 단백질이 회수되지만, 원하는 경우 추가 흡수 및 용출 라운드에서 추가 단백질을 회수할 수 있습니다.
6. 4회(또는 그 이상)의 흡수 및 용출이 완료되면 풀링된 정제된 단백질을 4°C에서 밤새 보관합니다. 니켈 수지는 다시 필요할 때까지 40°C에서 40% 에탄올 용액 20ml에 보관할 수 있습니다.

결과

그림 1: 순수 MOGtag 단백질을 생산하는 데 필요한 단계 개요. MOGtag 단백질을 생성하기 위해, MOGtag 단백질을 발현하는 박테리아를 고밀도로 성장시킨 후, 섹션 1에 나열된 바와 같이 IPTG를 사용하여 MOGtag를 발현하도록 유도한다. 하룻밤 배양 후, 박테리아를 용해하고, 일련의 펠릿화 단계를 거쳐, MOGtag를 함유한 봉입체를 함유한 단백질 분획을 섹션 1에 나열된 대로 추출...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BL21 대장균- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		이 박테리아는 MOGtag 단백질을 만드는 데 필요합니다. 이러한 박테리아의 글리세롤 스톡은 요청 시 제공됩니다.
LB 국물 밀러	Bioshop	LBL407.1
암피실린	바이오 염기성	AB0028	분말을 100 mg/ml에서 50% 에탄올/50% H₂O로 재구성합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	분말을 1M에서 H₂O로 재구성하고 -20°C에서 보관합니다.
닭-달걀 리소자임	Bioshop	LYS702.10	₂O에서 50 mg/ml로 재구성하고 -80°C에서 보관합니다.
Triton-X100	Sigma	T-8532
인산염 완충 식염수	Life technologies	20012-027	상업용 인산염 완충 식염수는 필요하지 않으며 표준 실험실에서 만든 인산염 완충 식염수로 충분합니다.
염화나트륨	바이오샵	SOD004.1
트리스-HCl	바이오샵	TRS002.1
이미다졸	바이오샵	IMD508.100
구아니딘-HCl	시그마	G3272	품질은 순도 98% 이상이어야 합니다.
0.5M EDTA	바이오샵	EDT111.500
황산니켈(II)	샵	NIC700.500
His 결합 수지	EMD Millipore	69670-3	°C에서 20% 에탄올 80% H₂O에 보관
수 에탄올	상업용 알코올	P016EAAN	필요에 따라 물로 희석하십시오.
빙초산	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
소 혈청 알부민 표준	bio-rad	500-0206
에틸렌디아민 테트라아세트산, 이나트륨염 이수화물	피셔 사이언티픽	BP120-500
폴리에틸렌글리콜 3350	Bioshop	PEG335.1
폴리에틸렌글리콜 8000	Bioshop	PEG800.1
초음파 발생기	피셔 과학	FB-120-110
나트륨 도데실 황산염	Bioshop	SDS001

H 바이오 4무