나노초 펄스 전기장 기술을 사용하여 시험관 내에서 Schwann 세포 성장 조절

초록

출처: Han, J., et.al. 시험관 내 말초 신경 재생을 위한 나노초 펄스 전기장에 의한 슈완 세포 성장 조절. J. Vis. 경험. (2024년)

이 비디오는 슈완 세포(SC) 성장을 조절하기 위한 나노초 펄스 전기장(nsPEF) 기술의 적용을 보여줍니다. 빠른 전기 펄스는 SC 막에 일시적인 나노 기공을 유도하여 SC 증식, 역분화 및 신경 영양 인자 분비를 유도하는 신호 전달 경로를 활성화하는 칼슘 유입을 촉진합니다. 이러한 세포 반응은 축삭 지원, 신경 생존 및 잠재적인 수초화를 향상시켜 nsPEF가 신경 복구를 위한 유망한 도구임을 강조합니다.

프로토콜

1. 동결보존된 RSC96 세포의 해동

세포 현

1. 탁액 1mL를 함유한 냉동계를 37°C 수조에서 급속히 흔들어 해동한 후 완전 배양 배지 4-6mL가 들어 있는 원심분리관에 넣고 잘 혼합한다.
2. 1000 x g에서 3-5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고 세포를 3mL의 완전 배양 배지에 재현탁합니다.
3. 세포 현탁액을 6-8mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 배양 플라스크(또는 접시)에 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다.
4. 다음날 현미경으로 세포 성장과 밀도를 관찰합니다.

2. 세포 통과:

참고: 세포 밀도가 80%-90%에 도달하면 통과 준비가 된 것입니다.

1. 배양 배지를 버리고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 1-2회 헹굽니다.
2. 배양 플라스크에 0.25%(w/v) 트립신-0.53mM EDTA를 첨가하고(T25 플라스크의 경우 1-2mL, T75 플라스크의 경우 2-3mL) 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
3. 현미경으로 세포 박리를 관찰하십시오. 대부분의 세포가 둥글게 되어 분리되면 플라스크를 재빨리 작업 영역으로 되돌리고 플라스크를 가볍게 두드린 다음 10% FBS가 함유된 배양 배지 3-4mL를 첨가하여 소화를 중지합니다.
4. 내용물을 혼합하고 용액을 흡인한 다음 1000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버리고 신선한 배양 배지 1-2mL를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현
탁합니다.
5. 세포 현탁액을 1:2 비율로 새 T25 플라스크에 옮기고 배양 배지 7mL를 추가합니다.

3. nsPEF 장치의 작동

1. RSC96 세포를 DMEM 배양 배지 1mL에 재현탁하고 양면에 전극이 있는 비색 접시에 옮깁니다.
2. 전원 스위치를 켭니다.
3. 기기의 손잡이를 돌려 파라미터를 조정하여 전기장의 강도를 변경합니다. 이 연구에서 설정된 강도는 5kV/cm, 10kV/cm, 20kV/cm 및 40kV/cm입니다.
4. 스파크가 나타날 때까지 전극을 조심스럽게 회전시켜 두 전극을 즉시 분리하기 전에 셀이 미리 설정된 전계 강도에 따라 nsPEF의 5펄스를 수신할 수 있도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Matsusada Precision Inc.	용 고전압 전원 공급 장치	AU-60P1.6-L
피펫	우한 자비에르 바이오테크놀로지 유한
RSC96 슈완 세포	우한 자비에르 바이오테크놀로지 유한	STCC30007G-1
스카니스터	3DHISTECH	파노라믹 MIDI
nsPEF	타임즈 마이크로파 시스템	M17/78-RG217

nsPEF 유한 용 특수 케이블