역행성 신경 추적을 위한 쥐 척수에 바이러스 벡터 주입

초록

출처: Keefe, KM, et al. 렌티바이러스 벡터의 직접 주사는 쥐 척수의 여러 운동 경로를 강조합니다. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 신경 경로를 추적하기 위해 쥐 척수에 고효율 역행 수송(HiRet) 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 바이러스는 시냅스 진입을 위한 당단백질과 형광 단백질 코딩 유전자를 가지고 있습니다. 바늘을 척수에 삽입하고 바이러스 현탁액을 제어된 속도로 투여합니다. 바늘은 바이러스 확산을 위한 충분한 시간을 허용한 후 최종적으로 빼냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 전 준비:

1. 나노리터 주사기용으로 설계된 3.5나노리터 유리 모세관 피펫을 사용하여 수술 며칠 전에 바이러스 주입을 위해 당긴 유리 바늘을 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 2단계 바늘 풀러에서 각 피펫을 당겨 2바늘 템플릿을 만듭니다.
2. 마이크로가위로 약 1-2mm의 여분의 유리를 잘라내어 바늘 템플릿의 끝을 다듬습니다. 현미경 교정 슬라이드를 사용하여 현미경으로 대략적인 조리개 크기를 측정하여 30-40μm 조리개를 가진 바늘을 분리합니다.
3. 바늘을 30°로 배치한 상태에서 마이크로피펫 베벨러를 사용하여 30-40μm 구멍과 45° 경사진 각도의 팁을 만듭니다. 보정 슬라이드의 버니어 눈금을 사용하여 조리개 너비를 확인합니다. 유연한 바늘이 부착된 주사기를 사용하여 유리 바늘을 통해 물과 에탄올을 통과시켜 부스러기를 씻어내고 일정한 간격으로 바늘에 검은색 마커로 표시합니다.
이전에
4. 70% 에탄올로 세척한 뚜껑이 있는 페트리 접시에 바늘을 넣고 자외선 또는 자외선 아래에서 생물안전 후드에서 30분 동안 멸균합니다.
5. 시술 직전에 냉동실에서 적절한 부피를 제거하여 고효율 역행 수송(HiRet) 렌티바이러스를 준비합니다.
   참고: 적절한 부피에는 주입에 필요한 양(주입당 1μL x 주입 횟수)과 피펫팅 및 로딩 손실을 고려한 소량의 추가 부피가 포함됩니다. 바이러스를 사용하지 않을 때는 얼음 위에 운반하고 보관하십시오.
6. 인젝터를 마이크로펌프에 연결하고 버니어 스케일이 있는 마이크로 매니퓰레이터에 넣어 인젝터를 준비합니다.
7. 유리 바늘을 준비하려면 유연한 바늘이 장착된 주사기에 빨간색 오일과 같은 유색 염료를 조심스럽게 넣으십시오. 바늘에 기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 바늘을 다룰 때는 무균 기술을 사용하고 팁을 만지지 마십시오.
8. 유리 바늘을 인젝터에 삽입하여 바늘이 와셔에 올바르게 장착되고 인젝터 캡이 단단히 조여져 있으며 강철 인젝터 바늘이 유리 바늘 길이의 약 3/4만큼 확장되었는지 확인합니다. 바이러스는 이후 단계에서 바늘에 로드될 수 있습니다.

2. 마취 및 수술 부위 준비

1. 디지털 저울로 동물의 무게를 측정합니다. 필요한 마취제의 양을 결정하고 수술 후 체중을 모니터링할 수 있도록 수술 전 체중을 기록합니다. 약 200-250g의 암컷 Sprague-Dawley 쥐가 이 프로토콜에 사용되었습니다.
2. 이소플루란 흡입 또는 주사된 케타민/자일라진 용액(k/x)을 사용하여 쥐를 마취합니다. 여기서, 케타민은 67mg/kg으로, 자일라진은 6.7mg/kg 용량으로 복강내 주사된다.
3. 발을 단단히 꼬집어 적절한 마취면을 확인하십시오. 반사적 금단이 발생하면 계속하기 전에 몇 분 더 기다리십시오.
   참고: 또한 수염, 눈, 호흡수를 관찰하여 의식의 징후가 있는지 확인하십시오. 수염이 경련을 일으키거나, 부드럽게 만졌을 때 눈이 깜박이거나, 호흡이 빠르고 얕은 경우 마취면이 더 깊어질 때까지 기다렸다가 프로토콜을 진행합니다. 또한 추궁 절제술 및 주사 수술 전반에 걸쳐 이러한 징후를 모니터링하십시오. 동물이 얕은 마취 평면을 보이면 원래 k/x 복용량의 1/2에 해당하는 케타민 단독의 부스터 샷을 투여합니다.
4. 엉덩이에서 견갑골의 하각까지 등쪽 정중선을 따라 쥐를 면도합니다. 동물의 피부를 팽팽하게 당겨 더 쉽고 정확하게 면도할 수 있습니다.
5. 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
6. 면도한 부위에 방부제를 발라 해당 부위를 살균합니다. 첫 번째 스크럽의 경우 멸균 거즈를 5% 요오드 용액에 담그고 모든 머리카락과 부스러기를 닦아냅니다. 그런 다음 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈로 단방향으로 스와이프하여 해당 부위에 두 번 닿지 않도록 합니다. 요오드와 에탄올에 적신 거즈를 번갈아 가며 동일한 기술을 두 번 더 사용하십시오.

3. 수술 부위 및 기구 준비

1. 메스, 롱저, 쥐 이빨 겸자, 스프링 가위, 지혈제, 중간 지점 곡선 겸자, 견인기 또는 가중 후크를 포함하는 고압멸균 수술 도구 세트를 준비하여 멸균 랩을 풀어 멸균 영역을 만듭니다.
2. 멸균 수술용 장갑 패키지를 열고 멸균 장갑 랩을 테이블 위에 놓습니다. 멸균 랩의 오염을 방지하기 위해 사용한 도구의 추가 멸균 영역으로 사용하십시오.
3. #10 메스 칼날을 멸균 필드에 떨어뜨립니다. 지혈제가 있는 손잡이에 칼날을 고정합니다. 멸균 식염수, 4.0 크롬 고양이 장 봉합사 및 소작기, 멸균 거즈, 멸균 면봉 어플리케이터(근육 출혈용) 또는 젤폼 또는 보네왁스(뼈 출혈용)와 같은 출혈 조절 재료를 접근 가능한 장소에 배치합니다.
4. 동물을 회수하여 멸균 천 위에 놓으십시오. 방광 아래에 거즈를 놓아 소변을 모으십시오. 복부 아래에 말아 놓은 수건으로 대상 부위를 받쳐 놓습니다. 가능한 경우 특히 장시간 시술의 경우 멸균 천 아래에 수술용 가열 패드를 놓으십시오.
   참고: 생존 수술 중에는 멸균이 중요합니다. 장갑을 낀 손의 무균 상태를 유지하기 위해 70% 에탄올이 담긴 스프레이 병을 준비하고, 기구 무균이 손상된 경우 또는 개별 수술 사이에 비드 멸균기를 사용하십시오.

4. 척추 노출 및 추궁 절제술 부위 식별

1. 마지막 갈비뼈를 손가락으로 부드럽게 눌러 Lumber 또는 L1 척추를 찾아 피부 절개를 할 부위를 식별합니다. 이것을 랜드마크로 삼아 L1보다 바로 아래쪽에 끝나는 #10 수술용 메스로 3-4cm 피부 절개를 하여 근육을 노출시킵니다. 깨끗한 절개를 위해 메스 칼날로 부드럽게 펴고 세게 눌러 피부를 팽팽하게 유지합니다.
2. 필요한 경우 집게와 가위로 표재성 지방을 자르고 펴십시오. (대상 척추에 따라 근육 표면에 큰 지방 패드가 있을 수도 있고 없을 수도 있습니다.)
3. 메스 칼날의 평평한 부분이나 손가락으로 극돌기를 느껴보세요. 종종 정중선 영역은 양쪽에 흰색 근막의 "V"로 윤곽이 그려집니다. 쥐 이빨 겸자로 상부 돌기에 단단히 잡을 수 있는 공간을 확보하기 위해 작은 절단을 한 다음 가능한 한 돌기에 가깝게 길고 깊은 절단을 두 번 만듭니다. 절단의 가장 깊은 지점에서 메스 칼날로 척추뼈의 등쪽 표면을 느낄 수 있습니다.
가
4. 시성을 높이기 위해 견인기나 가중치가 있는 후크를 사용하여 측면 근육을 옆으로 잡습니다. 메스, 스프링 가위 또는 롱저로 돌기 주변의 근육을 청소하여 머리 모양을 결정합니다.
   참고: 척수 조직은 뼈보다 발달 일찍 성장이 멈추기 때문에 척수는 척추의 전체 길이를 확장하지 않는다는 점을 기억하십시오. 이는 대상 척추 수준이 다른 이름의 척추뼈 아래에 있을 수 있음을 의미합니다.
5. 흉부 또는 T11과 인접한 T12 및 T13 돌기를 찾습니다.
   참고: 올바른 척추 수준을 목표로 삼는 데 도움이 되는 것은 쥐 척수 아틀라스 및 매우 유사한 척추 구조를 갖는 마우스의 랜드마크를 설명하는 이전 연구에서 찾을 수 있습니다6,33. 정중선 랜드마크를 제공하기 위해 T9와 같은 극돌기를 방해하지 않고 남겨 둡니다.

5. 추궁 절제술 수행

1. 대상 부위가 올바르게 식별되면 T11-T13의 등쪽 측면의 추궁 절제술을 수행합니다. 척추뼈를 부드럽게 펼쳐 뼈를 처음 물었을 때 롱저를 삽입하기에 좋은 부위인 추간인대를 드러냅니다. 미세한 제어력을 높이기 위해 롱저를 반쯤 닫은 위치로 유지하십시오.
2. rongeurs와 함께 작은 물기를 사용하여 척추의 극돌기와 등쪽을 제거합니다. 척수를 손상시키거나 경막을 방해하지 않도록 주의하십시오. 쥐 이빨 집게로 약간 들어 올려 척수를 척추뼈에서 멀리 당기고 척수 조직에 부딪히는 경향을 줄이는 데 도움이 됩니다.
3. 정중선 혈관을 관찰할 수 있도록 정중선에서 뼈를 제거합니다. 척수 조직이 명확하게 보이고 잔해물이 없는 창을 남겨두십시오.
4. 겸자로 척수를 부드럽게 만집니다. 일부 동물은 마취면이 깊어도 반사적으로 점프할 수 있습니다. 주사 과정에서 점프를 방지하기 위해 리도카인과 같은 마취제를 척수에 직접 몇 방울씩 떨어뜨립니다.
안
5. 정화 겸자를 척추 홀더에 고정하고, 척추 돌기, 및 꼬리 쪽을 추궁 절제술 창에 고정합니다. 호흡 동작의 영향을 무효화하기 위해 척추 홀더를 사용하여 동물의 복부를 들어 올립니다. 이렇게 하면 바늘 안정성이 향상되고 적절한 주입 깊이가 보장됩니다.

6. 바이러스 로딩 및 인젝터 위치 지정

1. 파라필름 조각에 약 5μL를 피펫팅하고 팁이 방울 내부에 오도록 바늘을 배치하여 바이러스를 인젝터에 로드합니다.
2. 마이크로펌프를 사용하여 20–100nL/s의 속도로 최대 4μL의 바이러스를 회수합니다.
바
3. 늘 끝이 막히지 않도록 바늘에서 소량의 바이러스를 주입하고 방출하도록 컨트롤러를 설정합니다. 실험실 물티슈로 과도한 바이러스를 닦아냅니다.
   참고: 강철 바늘이 있는 해밀턴 주사기를 당긴 유리 피펫의 대안으로 사용할 수 있습니다.
4. 버니어 스케일이 보이도록 마이크로 매니퓰레이터를 배치하고 바늘을 척수 정중선에 배치합니다.
   참고: 정중선은 때때로 척수의 앞쪽 표면을 흐르는 큰 혈관에 의해 위치할 수 있습니다. 그러나 이것은 개별 쥐마다 다를 수 있으며 정중선 표적화는 온전한 극돌기와 비교하여 확인되어야 합니다.
5. 마이크로 매니퓰레이터의 버니어 눈금을 사용하여 바늘을 측면으로 0.8mm 향하게 합니다.
6. 바늘이 경막에 구멍을 뚫지 않고 움푹 들어갈 때까지 척수까지 바늘을 내립니다. 빠르게 비틀면서 경막이 1.5mm 깊이까지 가라앉을 때까지 바늘로 경막을 뚫습니다.

7. 척수에 바이러스 주입

1. 바늘이 제자리에 있으면 400nL/min의 속도로 주입하도록 인젝터를 프로그래밍합니다. 염료 전면의 진행을 관찰하여 바이러스가 척수에 들어가고 있는지 확인합니다. 척수 조직의 명백한 누출이나 부풀어 오르는 현상이 없어야 합니다. 누출이 관찰되면 사출 속도를 200nL/min으로 줄여 이를 완화할 수 있습니다.
2. 주사가 끝나면 바늘을 척수에 2-5분 동안 그대로 두십시오(주입량에 따라 다름) 바이러스의 확산을 촉진합니다.
천
3. 천히 바늘을 빼고 다음 주사 부위로 이동합니다. L1-L4 척추 조직의 길이를 따라 약 1mm 간격으로 균일하게 간격을 둔 6개의 부위 각각에 1μL의 바이러스를 주입합니다. 제대로 작동하는 한 각 주사에 동일한 바늘을 사용할 수 있습니다.

8. 상처 봉합 및 수술 후 관리

1. 척추 홀더에서 동물을 제거하고 측면 근육을 퍼뜨리는 데 사용되는 견인기 또는 후크를 꺼냅니다. 닫기 전에 상처에 모든 파편이 없는지 확인하십시오.
2. 4.0 크롬 캣장 봉합사를 사용하여 근육을 봉합합니다. 내부 피부 자극의 가능성을 줄이기 위해 매듭 가까이에서 봉합사를 자릅니다.
3. 9mm 상처 클립을 사용하여 피부를 스테이플로 고정합니다. 최적의 치유를 위해 스테이플링하기 전에 피부 가장자리를 정렬하십시오.
4. 동물을 물 대류 온난화 패드 위에 놓고 깨어날 때까지 모니터링합니다.
5. 5-10mL의 멸균 식염수를 피하에 주사하여 체액을 보충하고 감염을 예방하기 위해 세파졸린과 같은 항생제를 주입합니다. 동물이 걸을 수 있을 때는 다시 집 우리에 넣고 초기 진통제를 제공하십시오. 쥐에게 통증과 고통의 징후가 있는지 모니터링하고 통증 완화를 위해 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 절차에 따라 치료하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#10 메스 블레이드	Roboz	RS-9801-10	메스와 함께 사용합니다.
1mL 주사기	Becton, Dickinson and Company	309659	취제 IP 주사, 잠재적인 마취제 부스터 샷 및 항생제 주사용.
10mL 주사기	Becton, Dickinson and Company	309604	수술 후 동물에게 식염수를 주입합니다.
4.0 크롬 Catgut 봉합사	DemeTECH	NN374-16	닫는 동안 근육을 다시 결합합니다.
48000 마이크로피펫 베벨러	월드 정밀 기기	32416	당겨진 유리 모세관의 끝을 베벨링하여 기능성 유리 바늘을 형성하는 데 사용됩니다.
5% 요오드 용액	퍼듀 프로덕츠 LP	L01020-08	수술 부위의 멸균에 사용합니다.
70% 에탄올	N/A	N/A	새로 준비된 유리 바늘, 수술 준비 중 동물 모델, 수술 중 외과 의사의 손 및 기타 모든 사소한 무균 유지의 멸균용.
마취제(케타민/자일라진 용액)	Zoetis	240048	수술 중 동물을 올바른 의식 평면에 유지하기 위한 것입니다.
항생제(세파졸린)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	수술 후 감염을 예방하기 위해 피하 주사합니다.
구슬 살균기	CellPoint	5-1450	수술 기구를 가열하여 살균합니다.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	뼈 출혈의 경우 뼈를 밀봉합니다.
소작기	정밀 과학 도구	18010-00	과도한 출혈을 방지하기 위해 수술 중 절단된 동맥이나 정맥을 밀봉합니다.
디지털 저울	Okaus	REV.005	수술 준비 중 동물의 무게를 측정합니다.
유연한 바늘 부착	세계 정밀 기기	MF34G-5	유리 바늘을 청소하고 유리 바늘에 빨간색 기름을 적재합니다
겔폼	화이자	H68079	뼈 출혈의 경우 뼈를 밀봉합니다.
유리 모세관	세계 정밀 기기	4878	당겨진 유리 바늘의 경우 - 나노리터 인젝터용으로 설계되어야 합니다.
이발기	Oster	111038-060-000	머리카락의 수술 부위를 청소하기 위해.
지혈제	Roboz	RS-7231	수술에 일반적으로 사용됩니다.
킴와이프 킴	텍	34155	수술에 일반적으로 사용됩니다.
중간 지점 곡선 겸자	Roboz	RS-5136	수술에 일반적으로 사용됩니다.
버니어 스케일이 있는 마이크로매니퓰레이터	Kanetec	N/A	수술 중 정확한 표적화를 위해.
마이크로 가위	Roboz	RS-5621	당긴 유리 모세관에서 유리를 절단합니다.
Light 및 Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	겨진 유리 모세관의 경사를 기능성 유리 바늘로 시각화하고 측정하는 데 사용됩니다.
MicroSyringe 펌프 컨트롤러	World Precision Instruments	62403	주입 속도를 제어합니다.
나노리터 2000 펌프 헤드 인젝터	세계 정밀 기기	500150	통제된 방식으로 바이러스를 로드하고 주입합니다.
바늘 풀러	나리시게	PC-100	유리 모세관을 가열하고 분리하여 유리 바늘을 형성합니다.
안구 연고	Dechra 수의학 제품	RAC 0119	수술 중 동물의 눈을 보호합니다.
파라필름	베미스	PM-996	나노인젝터에 바이러스를 로드하는 데 도움을 줍니다.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	모델을 주입할 수 있도록 1mL 및 10mL 주사기와 함께 사용합니다.
쥐 치아 겸자	Roboz	RS-5152	그립 극 돌기용.
레드 오일	N/A	N/A	주사 중 조직에 들어가는 바이러스를 시각화하기 위한 전면을 제공합니다.
견인기	Roboz	RS-6510	수술 상처를 열어두기 위해.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	수술 후 통증 관리용.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	수술 중 척추에서 근육을 제거합니다.
메스 블레이드 핸들	Roboz	RS-9843	수술 중 동물 모델의 피부와 지방 패드를 자릅니다.
가위	Roboz	RS-5980	수술에 일반적으로 사용됩니다.
스테인리스 스틸 상처 클립	CellPoint	201-1000	봉합 중에 수술 상처의 피부를 묶습니다.
스테이플 제거 겸자	Kent Scientific	INS750347	스테이플을 제거하려면 잘못 적용한 경우.
멸균 천	피닉스 연구 제품	BP-989	수술을 위한 멸균 표면을 제공합니다.
멸균 면봉 어플리케이터	Puritan	806-WC	무균 상태를 유지하면서 수술 상처의 혈액을 흡수합니다.
멸균 거즈	Covidien	2146	무균 상태를 유지하면서 수술 부위와 수술 도구를 청소합니다.
멸균 식염수	Baxter Healthcare Corporation	281324	혈액 제거 및 수술 후 체액 교체에 사용됩니다.
수술용 장갑	N/A	N/A	외과의가 수술 중 멸균 영역을 유지하기 위해 사용합니다.
수술용 가열 패드	N/A	N/A	수술 중 동물 모델의 체온을 유지하기 위해.
수술용 현미경	N/A	N/A	수술 상처의 시각화 향상을 위해.
수술용 스테이플러	Kent Scientific	INS750546	스테이플을 적용합니다.
T/펌프 열요법 워터 펌프	Gaymar	TP500C	물 대류 온난화 패드에 따뜻한 물을 펌핑합니다.
물 대류 온난화 패드	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	의식을 잃은 동물의 체온을 유지하기 위해 수술 후 회복 영역에서 사용합니다.
가중 후크	N/A	N/	A 수술 상처를 열어두기 위해.

마. 새로 가 있는 현미경 당 동물