당뇨병 쥐 모델에서 신경 활동 전위를 차단하기 위한 고강도 집속 초음파

초록

출처: Lee, YF, et al. 당뇨병 쥐 모델에서 신경 전도 차단을 위한 초음파 도구. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 당뇨병 쥐 모델에서 좌골 신경에서 비복근까지의 활동 전위를 차단하기 위해 고강도 집속 초음파(HIFU)를 사용하는 방법을 보여줍니다. HIFU 빔을 신경에 전달하면 근육 신호가 감소하면 당뇨병성 신경병성 통증 완화를 위한 비침습적 치료법으로서의 HIFU의 잠재력이 확인됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. HIFU(High-Intensity Focused Ultrasound) 변환기를 사용한 생체 내 신경 전도 차단

참고: 생체 내 실험은 50mg/kg 스트렙토조토신(STZ) 주사 후 5주차에 시작됩니다.

1. HIFU 초음파 처리로 복합 근육 활동 전위 (CMAP)을 차단하기 전에 동물 절차를 수행하십시오.
   1. 수술 전 수술 도구(메스, 가위, 겸자, 유리 후크)를 오토클레이브에서 소독하십시오.
   2. 틸레타민/졸라제팜 혼합물(40mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사 또는 이소플루란 기화기를 통해 1.75%의 이소플루란을 흡입하여 쥐를 마취시킵니다. 쥐의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 위에 쥐를 올려 놓습니다.
   3. 수술을 위해 쥐를 복부 누운 자세로 배치합니다. 눈 연고를 바르십시오. 쥐의 다리를 펴고 손톱으로 발바닥 표면을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 쥐가 금단 반응을 보이면 추가 마취를 적용하십시오.
   4. 전기 이발기로 쥐의 허벅지와 허리의 털을 제거합니다. 수술 부위에 깨끗한 거즈로 액체 요오드를 바르고 거즈를 수술 부위에서 바깥쪽으로 원을 그리며 움직입니다. 알코올 패드를 사용하여 동일한 원을 그리며 액체 요오드를 닦습니다. 이 실험은 왼쪽과 오른쪽 수술 부위에서 수행됩니다. 절차의 다음 단계를 수행할 때 다른 수술 부위에서 절차를 반복합니다.
   5. 멸균 수술용 가위나 메스를 사용하여 허벅지 등쪽 피부를 절개합니다. 뭉툭한 수술용 가위를 사용하여 피부 아래 조직을 조심스럽게 분리하고 피부 후크로 피부를 고정합니다. 대퇴골은 근육 내에서 볼 수 있습니다.
   6. 가위를 사용하여 근육에 박힌 허벅지 중간 좌골 신경 섬유가 보일 때까지 대퇴골과 평행한 근육을 조심스럽게 분리합니다. 유리 후크를 조심스럽게 사용하여 허벅지 중간 좌골 신경을 주변 결합 조직 및 근육과 분리합니다.
2. 맞춤형 신경 고정 장치를 사용하여 HIFU 초점 영역에 좌골 신경을 배치합니다(그림 1 및 그림 2).
   참고: 맞춤형 신경 고정 장치는 3가지 구성 요소로 구성됩니다(그림 2). 모든 구성 요소는 투명한 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)로 만들어집니다. 구성 요소 I의 상단 구조의 수나사는 높이가 2.5mm이고 M10XP0.7입니다(그림 3A). 중앙 우물은 구성 요소 I을 통과하는 직경 4.0mm의 구멍입니다. 우물의 바닥 구멍은 테이프로 밀봉되어 있습니다. 슬롯의 직경은 1.2mm이고 슬롯의 중심면과 부품 I의 상단 표면 사이의 거리는 3.1mm입니다. 구성 요소 II는 본체, 4개의 다리 및 하단 구조로 구성됩니다(그림 3B). 하단 구조의 암나사는 높이가 2.5mm이고 M10XP0.7로 부품 I의 수나사에 맞습니다. 중앙 구멍의 직경은 구성 요소 I의 중앙 우물과 동일합니다. 본체의 치수는 직경 32mm, 두께 5.4mm입니다. 네 개의 다리가 대칭으로 전개됩니다. 두 개의 동일한 짧은 다리는 정렬을 위해 설계되었으며 두 개의 동일한 긴 다리는 구성 요소 III에 걸기 위해 작동합니다. 구성 요소 III의 외경과 높이는 41mm와 9.2mm입니다. 내부 나사산은 M36XP1.0이고 관통 구멍의 직경은 27.5mm입니다(그림 3C). 원뿔은 상단 개구부 직경 84mm, 하단 개구부 직경 27.5mm가 있는 속이 빈 테이퍼입니다. 높이는 57.5mm입니다(그림 4A).
   1. 실험 전에 맞춤형 아크릴 신경 고정 장치를 표백제 용액에 30 - 60분 동안 담근 다음 멸균수에 담그십시오.
   2. 유리 고리를 사용하여 신경을 조심스럽게 들어 올려 구성 요소 I의 슬롯에 넣습니다.
   3. 구성 요소 II를 구성 요소 I에 나사로 고정합니다. 초음파 전파 및 신경 보존을 위해 구성 요소 I의 중앙 웰을 링거 용액으로 채웁니다.
   4. 구성 요소 III을 HIFU 하우징 콘에 나사로 고정합니다. 구성 요소 II의 네 다리를 통해 구성 요소 III을 구성 요소 II와 도킹합니다.
      참고: 세 구성 요소와 변환기의 기하학적 중심이 정렬됩니다. 신경과 변환기 사이의 거리는 초점 거리와 같으므로 신경이 HIFU 초점 영역 내부에 있는지 확인합니다.
3. 한 쌍의 침술 바늘을 좌골 신경의 기원에 삽입하고 다른 한 쌍을 비복근에 삽입합니다. 전기 동축 케이블을 통해 각 바늘 쌍을 전기생리학 수집 시스템에 연결합니다(그림 1).
   참고: 케이블의 한쪽 끝에는 두 개의 바늘을 별도로 클립할 수 있는 두 개의 악어 클립이 있고 케이블의 다른 쪽 끝에는 시스템을 연결하기 위한 총검 Neill-Concelman(BNC) 커넥터가 있습니다. 한 쌍의 침술 바늘은 좌골 신경에서 자극 전극과 비복근에서 기록 전극으로 작용합니다.
   1. 전기생리학 수집 시스템의 샘플링 속도와 대역폭을 각각 50kHz 및 70Hz-3kHz로 설정합니다. 좌골 신경의 기점에 있는 자극 전극에 펄스 폭이 0.1ms인
   최대 자극을 적용합니다.
   2. 기록 전극에서 CMAP를 기록하고 전기 생리학 획득 시스템에 내장된 증폭기로 CMAP를 증폭합니다.
      참고: 전기생리학 획득 시스템에 내장된 증폭기를 사용하여 신경 신호를 증폭하고 전기생리학 획득 시스템으로 기록 전극의 CMAP를 기록합니다.
4. 상용 2.68MHz HIFU 변환기를 사용하여 당뇨병성 신경병성 쥐에서 CMAP를 억제하십시오.
   참고: 변환기의 사양은 다음과 같이 설명됩니다: 조리개 직경이 6cm이고 초점 거리가 5cm인 단일 요소 구형 보울, 자유 필드에서 깊이 4mm, 너비 0.8mm의 타원체 초점 영역.
   탈
   1. 기수로 채워진 탱크에 구형 원뿔, HIFU 변환기 및 원뿔 덮개를 담급니다. HIFU 변환기를 구형 원뿔에 넣고 6개의 헤드 나사로 원뿔 덮개를 구형 원뿔의 상단 구멍에 고정합니다(그림 4B). 물에 비해 기포의 밀도가 낮기 때문에 구형 원뿔의 기포가 자연적으로 배출된 후 원뿔의 앞쪽 개구부를 0.03mm 두께의 투명 테이프로 밀봉합니다. 구성품 III을 구형 원뿔에 나사로 고정합니다.
   2. 탈기된 물 탱크에서 구형 원뿔과 구성 요소 III이 있는 HIFU 변환기를 꺼냅니다.
      참고: 연구에 사용된 역삼투압(RO) 물은 역삼투압 과정에 의해 정화된 물입니다. RO 물을 끓여 가스를 배출합니다. 냉각 후 탈기된 물은 개별 밀봉 탱크에서 얻어집니다.
5. 구성 요소 I을 신경과 근육 사이의 공간에 조심스럽게 넣고 구성 요소 I의 틈에 신경을 배치합니다. 1.2.3 및 1.2.4단계를 수행하여 신경이 HIFU의 초점 영역 내부에 있는지 확인합니다(그림 2A).
6. 함수 발생기와 무선 주파수 전력 증폭기를 연결합니다. 전력 증폭기를 HIFU 변환기에 연결하여 HIFU 빔을 생성합니다. 수동으로 볼륨을 설정합니다.tage 함수 발생기의 출력은 전력 증폭기를 통해 HIFU 변환기에 전달됩니다. HIFU 노출 시간이 끝나면 함수 발생기를 수동으로 끕니다. 타이머를 사용하여 시간을 관찰하십시오.
   참고: 이 연구에 사용된 HIFU 빔의 강도와 에너지는 각각 2,810W/^cm2 및 84J/^mm2입니다.
7. 동시에 CMAP를 기록하는 동안 전기생리학 획득 시스템(1.3단계)을 통해 자극을 전달하고 HIFU 시스템(1.6단계)을 통해 HIFU 빔을 좌골 신경에 전달합니다. 좌골 신경에 대한 HIFU 노출을 3초, 5초에서 8초로 점진적으로 증가시킵니다.
   1. HIFU 빔을 전달하는 동안 초당 한 번 CMAP를 기록합니다. CMAP의 진폭 변화를 관찰한 후 HIFU 시스템을 끄고 전기생리학 획득 소프트웨어의 기록 아이콘을 수동으로 클릭하여 초반 10분에는 2분마다, 연속 30분에는 5분마다, 기록 시간이 2시간에 도달할 때까지 마지막 단계에서 10분마다 CMAP를 기록합니다.
8. 신경 고정 장치(그림 2)의 구성 요소 II와 III을 분리하여 절개 부위에서 HIFU 변환기를 제거합니다. 고정된 좌골 신경을 풀기 위해 구성 요소 II와 I을 분리합니다. CMAP를 기록한 후 4-0 크롬 catgut 봉합사로 당뇨병 쥐의 수술 부위를 봉합합니다. 감염을 예방하기 위해 수술 부위에 액체 요오드를 바르십시오.
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   1. 지를 가열 패드 위에 놓고 쥐가 동물 시설로 돌아가기 전에 우리에서 회복할 수 있도록 합니다. 쥐에게 3일 동안 식수에 이부프로펜을 제공하거나 부프레노르핀(0.05 - 0.1 mg/kg)을 복강내 주사합니다.
9. 초기 HIFU 초음파 처리 후 7일, 14일 및 28일에 마취된 당뇨병성 신경병성 쥐의 좌골 신경과 비복근의 기원에 자극 및 기록 전극을 삽입합니다.

결과

그림 1: 고강도 집속 초음파(HIFU)를 사용한 생체 내 신경 전도 차단을 위한 실험 설정 . (A) 역삼투압 탈기수로 채워진 맞춤형 아크릴 구형 원뿔을 신경 고정 장치와 결합하여 HIFU 변환기의 초점 영역이 신경의 초점면에 있도록 했습니다. (B) 자극 및 기록 전극이 그림에 나와 있습니다. 신경 고정 장치는 좌골 신경을 HIFU 빔의 초점면에 배치했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 획득 시스템	Biopac Systems, Inc.
HIFU 변환기	Sonic Concepts	H108
함수 발생	Agilent	33250A
전력 증폭기	전자 및 혁신	1040L
Rats	Biolasco 대만	Sprague-Dawley
Puralube 수의사 연고	Dechra
Isoflurane 기화기	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurane	아타네

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