여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을 악용 E. 대장균 음이온 교환 크로마 토그래피, TEV 프로 테아제와 His6 태그 제거, 크기 - 배제 크로마 토그래피에 의해 따랐다.
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이 논문에서
요약
초록
Hsp104는 효모에서 hexameric AAA + 단백질 1, 단백질 disaggregation 20-10로 커플 ATP의 가수 분해 (그림 1)입니다. 이 활동은 두 가지 핵심 선택적 장점을 부여. 첫째, Hsp104에 의해 무질서 집계의 renaturation는 열 충격 3,5,11,12를 포함하여 다양한 단백질 misfolding 스트레스 후 효모 생존을 최대한 활용하십시오. 둘째, Hsp104에 의해 교차 베타 아밀로이드 원섬유의 리모델링은 유익한의 저수지로 수많은 prions (전염성 amyloids)를 이용하여 13-22 phenotypic 변화를 물려 전할 수있는하는 효모 수 있습니다. 현저하게, Hsp104 직접 효모 prion 단백질 Sup35 및 Ure2 23-30로 구성 포함 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 remodels. 이 아밀로이드 - 리모델링 기능은 효모 Hsp104 전문 패싯입니다. E. 대장균의 orthologue, ClpB는 리모델링의 preamyloid의 oligomers 또는 아밀로이드 원섬유 26,31,32에 실패합니다.
Hsp104의 orthologues는 동물, perplexingly,를 제외하고 삶의 모든 왕국에서 볼 수 있습니다. 사실, 동물 세포가 어떤 효소 시스템을 가지고 있는지 여부를 renaturation (오히려 저하 이상)에 커플 단백질 disaggregation 알 수없는 33-35 유지. 따라서, 우리와 다른 Hsp104가 독성 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유 4,7,23,36-38에 특정 단백질의 misfolding과 관련된 다양한 neurodegenerative 질병에 대한 치료 요원으로 개발을지도 모른다고 제안했습니다. 직접 질병와 관련된 집계 종을 대상도 트리 트먼트가 없습니다. 그러나 Hsp104는 파킨슨병 23뿐만 아니라 PrP 39 아밀로이드 형태로 연결되어있는 알파 synuclein의 구성 독성 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 녹이고. 중요한 것은 Hsp104는 단백질 집합을 줄이고 파킨슨병 23 헌팅턴의 질병 38 설치류 모델에서 neurodegeneration을 ameliorates. 이상적으로, 치료를 최적화하고 부작용을 최소화하기 위해, Hsp104 공학 및 선택 질문 4,7의 질병에 중앙 구체적인 집계를 개조하는 potentiated 것입니다. 그러나, 어떻게 Hsp104 disaggregates의 제한된 구조 및 기계론의 이해 집계 구조와 관련이없는 단백질 같은 다양한 레퍼토리이 노력에게 30,40-42을 좌절.
Hsp104의 구조와 메커니즘을 이해하기 위해서는 최소한의 구성 요소로 순수 단백질과 reconstitute의 disaggregase 활동을 연구하는 것이 필수적입니다. Hsp104는 ADP 또는 ATP의 존재 또는 염기 43-46의 부재 높은 단백질 농도에 hexamerizes ~ 5.3의 PI와 102kDa 단백질이다. 여기, 우리는 E.에서 매우 적극적인, 안정적인 Hsp104의 정화를 위해 최적화된 프로토콜을 설명 대장균. E.의 사용 대장균은 단순 대규모 생산을 허용하고 우리의 방법은 여러 Hsp104 변종에 대한 신속하고 안정적으로 수행할 수 있습니다. 우리 프로토콜 Hsp104 순도를 높이고 E.에서 이전 정화 방법에 비해 그의 6 태그 제거를 단순화 대장균 47. 또한, 우리의 프로토콜을 두 개 더 최근의 프로토콜 26,48보다 손쉬운하고 편리합니다.
프로토콜
1. Hsp104 표현
- 플라스미드가 E.에 정화를위한 고용 대장균, pPROEX - HTb - Hsp104은 TRC업자 26 inducible 제어 아래에있는 Hsp104 오픈 읽기 프레임이 포함되어 있습니다. 플라스미드는 TEV 테아제 절단하여 제거할 수 있습니다 N - 터미널 그의 6 태그 Hsp104을 생산하고 있습니다. 코돈 최적화 E.에 pPROEX - HTb - Hsp104 변환 전형적인 세균의 변환 절차를 사용하여 대장균은 BL21 - CodonPlus - RIL 전지 (Stratagene, 애질런트 테크놀로지) (예 : 제조 업체의 지시에 따라). 코돈 최적화 E.을 사용하는 것이 중요하다 Hsp104가 특이한 코돈 바이어스가 있기 때문에 대장균이 변형.
- 100mL 2XYT 문화 (USB.의 레시피 : 16g / L 카세 펩톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L NaCl, 산도 7.0) 예방 100μg/mL 암피실린 신선한 transformants와 34μg/mL chloramphenicol과 보충과 37 야간 성장 ° 200rpm에서 잡고 C.
- 6 2L flask....
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토론
타임 라인 : 최대한 Hsp104 활동에 우리가 전체 정화 체계는 최대한 신속하게 완료하는 것이 좋습니다. 그러나, 정화 단계의 숫자는 항상 실용적되지 않을 수 있습니다 요구하는 일정을 만듭니다. 정화 단계가 가능한 빨리 실시하는 경우, 30에서 부화의 2-4시간까지 밤새 표현의 마지막에서 시간 ° TEV 프로 테아제와 C가 약 9~11시간입니다. 일시 정지 한 잠재적인 장소는 TEV 절단 단계를 수행합니다. 절대적으로 필요한 경우 Hsp104은 (단계 5.2) 위에서 설명한대로이 단계 이후 냉동 스냅 수 있습니다. 해동 및 정화 Hsp104가 다음 생화학 assays 즉시 사용해야합니다 후 크기 배제 크로마 토그래피 (단계 3.9)은 다음 즉시 수행됩니다. 또한 유도 단계는 37에서 2 시간 간소 수 있습니다 ·이가 감소하지만 C는 전반 얻을 수 있습니다.
잠재 합병증이 정화 방식과 똑바로 앞으로이다. 그러나, 몇 가지 중요한 단계 및 절차 대안은 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH (5T32GM008275 - 22)와 미국 심장 협회 predoctoral 교제 (EAS)을에서 교부금에 의해 지원되었다; 화학 - 생물학 인터페이스 NIH (2T32GM071339 - 06A1) (MED로)에서 원정, 그리고으로부터 보조금 NIH (1DP2OD002177 - 01 및 NS067354 - 0110), 엘리슨 의료 재단, 그리고 빌과 멜린다 게이츠 재단 (JS로).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| BL21 - CodonPlus - RIL 관할 전지 | Stratagene, 애질런트 테크놀로지 | 230255 | |
| 2XYT 국물 | USB | 75,864 | |
| 완료, 미니, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제의 정제 | 호슈 | 1,836,170 | |
| Pepstatin | 시그마 | P4265 | |
| NI - 세파 로스 6 빠른 흐름 | GE 헬스케어 | 17-5318-02 | |
| Amicon 울트라 - 15 원심 필터 유닛 (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 | |
| 자원 Q - 6ml 칼럼 | GE 헬스케어 | 17-1179-01 | |
| proTEV 프로 테아제 | Promega | V6052 | |
| AcTEV 프로 테아제 | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 3백분의 10 GL | GE 헬스케어 | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | 분석 설계 | SPP - 400 | |
| Hsp72 | 분석 설계 | ADI - NSP - 555 |
참고문헌
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System th....
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