우리는 설명을 체외에서 방법 Schistosoma mansoni 담수 달팽이 중간 호스트 Biomphalaria의 glabrata에서 infective의 cercariae의 수확과 변화를 통해.
방법 논문
Cercarial 변화와 체외에서 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules
이 논문에서
요약
초록
Schistosome 기생충 주혈흡충증 (기생충병), 전세계 2 억 명 이상에 영향을하고 공중 보건 및 사회 경제적 영향 (1-4)의 관점에서 기생 질병 사이에 말라리아의 두번째 계급 만성 쇠약 질병의 원인이되는 에이전트입니다. Schistosome 기생충이 복잡한 라이프 사이클은 자유 수영 단계를 개입과 연체 동물과 포유류의 호스트에서 기생 생활 사이 interchanging와 흡충의 벌레입니다. 간단히, 자유 수영 cercariae는 schistosomules로 변모, cercariae들이 꼬리를 잃게되는 시간 동안, 분비 프로 테아제의 도움으로 피부를 관통하여 포유류의 호스트를 감염. schistosomules 이제 호스트 면역 체계를 회피 적혈구의 소화에 대한 직감을 개발하고, 마이 그 레이션해야하지만 폐, 간장 포털 시스템에서 자신의 최종 목적지로가는 도중 포털 순환 결국 mesenteric 정맥 (S. mansoni에 대한) 남성과 여성 웜 쌍 및 친구는, 매일 계란의 수백 생산 어디에. 계란의 일부는 계란은 자유 수영 miracidia (5-10)에 해치 신선한 물로 신체에서 배설됩니다. miracidia 특정 달팽이 종의 감염과 차례로, 생활주기를 완료, infective의 cercariae를 만들어 엄마와 딸 sporocysts로 변환. 불행하게도, 전체 schistosome 생활주기는 체외에서 배양해 수 없다지만, infective의 cercariae는 schistosomules로 변환 될 수 있으며, schistosomules는 체외 또는 microarray 분석 schistosome 개발의 분석을 위해 주 동안 교양 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cercarial 변화와 schistosomules의 체외의 culturing의 시각적 설명을 제공합니다. 우리는 달팽이를 호스트 Biomphalaria의 glabrata에서 전염성 cercariae를 버리고 수동 emulsifying 두 종단 바늘을 사용하여 꼬리를 분리하여 schistosomules로 그들을 변형. 체외 cercarial 변화와 schistosomules 문화 기술의는 schistosomes의 시각화를 단순화하고 실험 분석에 대한 기생충의 수집을 용이하게합니다. 체외 변환 및 schistosomes의 culturing 기술의 년간 수행되었습니다 포유류의 호스트 (11의 사용을 피하 설명 12),하지만 시각적인 프로토콜은 전체 커뮤니티에 사용할 수 있습니다 개발되지 않았습니다.
프로토콜
안전 대책 :
Schistosome cercariae 직접 절단이나 모공의 필요없이 피부를 침투하고, 만성 질병 주혈흡충증 (기생충병)가 발생할 수 있습니다. S.은 mansoni는 biosafety 레벨 2 생물, 따라서 적절한 개인 보호 장비이며, infective의 cercaria 작업을 할 때 적절한 안전 조치가 따라야한다. schistosomes을 성장하고 변화하는 데 필요한 장비의 대부분은 프로토콜의 끝에있는 테이블에 명시된 바와 같이 몇 가지 중요한 예외와 함께, 표준입니다. 모든 cercarial 작품은 외딴 방에서 수행되어야합니다. Schistosomules는 살균, 승인 biosafety 후드에 교양하여야한다. nitrile 또는 라텍스 장갑 두 레이어는 착용한다로 실험실 외투, 신발의 방수 쌍, 손목과 팔을 구멍이나 눈물, 그리고 방수 슬리브 보호 장치와 함께 바지를해야합니다. 사고 유출의 경우, 즉시 적극적으로 당신의 사람에 경우 바르고, 70 % 에탄올 또는 10 %의 표백제로 오염된 지역을 스프레이. 이것은 기생충을 해제 충분하지만, 가능한 모든 감염은보고 심각하게 이동해야합니다. schistosomules가 innately infective 아니지만, 제도적 지침 다양하고, BSL2주의가 noninfectious 생활 단계 동안 필요한지 여부를 확인할 수 협의해야합니다. 실험이 승인된 생물 학적 컨테이너에서 수행하고 폐기물을 폐기 후 모든 잠재적으로 전염성 물질과 접촉에 와서 모든 표면을 소독.
참고 : 표지 달팽이 호스트 용기 1-2일 사전 흘리기와 빛으로부터 보호하기 위해
1. 달팽이 호스트에서 cercariae 수확
- 실내 온도 equilibrated 증류수와 중간 전체 세제 무료로 깨끗하고, 500mL 비커를 입력합니다. 다른 날짜에 miracidia 감염된 호스트 달팽이와 함께 일하고있다면, (달팽이가 이후의 실험에 대한 재사용 될 경우 이것은 특히 중요합니다) 각 감염 기간에 대한 별도의 비이커를 사용합니다. 비커의 크기는 또한 사용자의 경험에 따라 작은 수 있습니다.
- 당신은 필요에 따라 네트워크 표준 수족관 물고기, 일반 목적의 집게를 사용하여 비이커에서 그들을 창고 조심스럽게 입금하고자하는 감염된 달팽이 호스트를 수집합니다.
- 비상 노출에 대한 플레이스 비커는 백열 광원 아래 약 8-12인치을 트레이. 불빛 아래 1-2시간에 대한있게 해줘요. 밝은 빛에 노출되면 Cercariae는 달팽이 호스트를 종료합니다.
- 조심스럽게 cercariae 혼합물에서 달팽이를 필터링합니다. 혼합물은 매우 전염성이므로, 별도의 안전 조치를 가져가라. 기억 cercariae 직접 인간의 피부를 뚫을 수 있습니다!
- 어떤 입자의 쓰레기 문제 해결 수 있도록 약 15 분 동안 광원에 따라 혼합물을 교체하십시오.
- 비커의 하단에있는 파편을 피하기 위해, pipet을 사용하여 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크에 cercariae을 전송합니다. 60 분 cercariae 한 구석에 정착 있도록 - 45 어둠 속에 얼음에 약 45 ° 각도로 술병를 놓습니다.
- 뜨는의 75-90%를 제거하고 10 % 표백 제나 70 % 에탄올을 포함하는 비커에 입금, 물 방울이 pipet에서 cercariae의 드립을 포함하도록하지 간병하기 위해 50 ML의 pipet을 사용합니다.
- 소용돌이 Erlenmeyer 플라스크는 솔루션 cercariae을 resuspend을 부드럽게 cercariae을 포함. 무균 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 전송하는 pipet을 사용합니다. 어둠 속에서 20 분간 얼음에 다시 튜브를 삽입합니다. Cercariae는 어둠 속에서 튜브의 아래쪽으로 해결됩니다.
2. schistosomules에 cercariae의 수동 변환
당신이 시작하기 전에 : RPMI 1640 완료 (RPMI 5 % 태아 소 혈청, 1X 펜 / Strep)와 37 ° C.에 따뜻한 확인 (그것은 사용되는 태아 소 혈청이 배양에 의해 inactivated했다는 중요합니다 56 ° C schistosomes가 보완에 민감 수 있으므로 1 시간).
- 생물 학적 후드에서 pipettor 또는 진공 장치를 사용하여 각 50 ML 원뿔의 솔루션 5-10 ML로 뜨는 제거합니다.
- luer 록이 적절하게 크기 주사기에 바늘을 emulsifying 두 번 끝난 22 게이지를 부착합니다.
- 천천히 주사기에 혼합을 그립니다. 주사기 50 ML 튜브에서 cercariae를 수집합니다. 흘리지의 세심한한다.
- 조심스럽게 무소속 바늘 끝가있다 그러한 이상의 주사기를 켜십시오. emulsifying 바늘이 측면에 다른 주사기를 첨부하십시오.
- cercariae를 변환하기 위해서 주사 바늘을 통해 40 회 (앞뒤로 20 회)의 총 혼합물을 전달합니다.
- 혼합물이 아래의 주사기에 포함되어 상단 주사기가 비어 있는지 세로로 같은 주사기를 놓습니다. 최고 주사기를 제거하고 70 % 에탄올로 소독.
- 깨끗한 높은 벽으로 둘러싸인 100mm X 50mm pyrex 요리 또는 crystallizing 그릇에 드롭하여 보증금 혼합 놓습니다. 70 % 에탄올에 바늘과 주사기를 소독.
- 37 ° C RPMI 1640 전체 미디어와 같은 추가되는Luria의 국물 플레이트를 따르고처럼 배양 접시의 바닥이 완전히 덮여 있습니다.
- 페트리 접시의 중앙에 schistosomules를 수집하는 부드럽게 소용돌이. 물 튀기지 마십시오.
참고 : 더 적절하게 중앙에 schistosomules을 시각화하기 위해이 단계에 대한 후드 라이트를 해제하는 것이 유용할 수 있습니다. - 즉시 멸균 스포이트를 사용하여 잘 신선한 12 웰 세포 배양 플레이트에 집중 schistosomules를 입금.
- schistosomules 더 이상 접시 (약 10 배)의 중심에 존재하지 않습니다 때까지 2.9와 2.10를 반복합니다. 신선한 잘 각 후속 컬렉션을 입금.
- 물론 최대 중간 (~ 1.5 ML) prewarmed RPMI 전체 미디어 각각 입력합니다.
- schistosomules 및 cercariae 부재의 존재를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 시각화.
- 성장 CO 2 배양기에서 schistosomules 37으로 설정되어 ° C와 5% CO 2.
3. 대표 결과 :
문화 미디어로 변모 schistosomules의 보류중인 전송, 거꾸로 밝은 - 필드 현미경 (예를 들어, 장비 표 참조) 아래의 시각화는 변형 schistosomules가 우물에 존재하는 1, 그림과 비슷한 이미지를 얻을 수 있습니다. 잠재적인 오염 물질은 그대로 cercariae, 절단 cercarial 꼬리, 또는 기타 이물질을 포함 수 있습니다. 더 거꾸로 현미경을 사용할 수 없다면, 표준 현미경 또는 해부 범위는 schistosomules을 시각화하기에 충분합니다. 이 절차는 항상 cercariae의 100 %를 변환하지 않습니다.
그림 1 : 변환 Schistosomulum
그림 2 : Cercariae 및 잘린 꼬리
토론
몇 가지 잠재적인 문제는 변환 과정에서 발생할 수 있지만,이 프로토콜은 이러한 문제의 대부분을 방지하도록 설계되었습니다. 한 잠재적인 위험은 일반적으로 단계 1.3 수확의 남은 잔해로 인해 발생 emulsifying 바늘의 막히는입니다. 단계 1.5에서 정착하고 단계 1.6에서 신중하게 cercariae를 전송하는 모든 미립자 물질이 문제를 방지하도록해야합니다. 또한, 생물 학적 안전 캐비닛 내부 작업 전에 설명, 개인 보호 장비의 사용 (심지어 얼굴 방패)와 주사기에 과도한 압력의 소지를 없애기는 것이 좋습니다.
분리된 cercarial 꼬리 단계 2.9 동안 가난한 분리 지표는 미디어에 시각하실 수 있습니다. 꼬리는 경련 같은 운동을 전시하고 독특한 모양을 (그림 2 참조), 그리고 표현할수 schistosomules에서 쉽게 구별할 수 있습니다. 꼬리는 schistosomules가 정착 있도록 전체 RPMI 초과 schistosomules을 세척하여 제거할 수 있습니다. 꼬리가 떠있는 상태로 유지됩니다 끌 진공 청소기로 청소를하실 수 있습니다.
그대로 cercariae는 미디어 존재하는 경우 단계 2.5의 변화가 제대로 실행되지 않았습니다. 손상 cercaria의 이미지를 참조 그림 3B에 그려져 있습니다. 이 문제가 발생하면, 사용중인 emulsifying 바늘이 적당한 크기입니다 확보. 40 번정도는 일반적으로 충분히 cercarial 꼬리의 100 %의 전단에 접근하는 것보다 훨씬 더 있지만 또한, cercarial 혼합물이 바늘 통과 횟수가 증가 수 있습니다.
schistosomules에 cercaria의 변화가 먼저 콜리와 Wikel (13)에 의해 1974 년에 설명했다. 이후 schistosomules의 준비는 본 논문에서 입증이 프로토콜의 설명, 또는 vortexing 접근법을 사용하고 percoll의 그라디언트로 구분 (14, 15) 또는 소용돌이로 바늘과 주사기와 어느 전단 전략을 사용하여 수행되었습니다. 준비 schistosomules에 대한이 두 기술은 아름답게 프레드 루이스 (16)보다 장기적인 성장을위한 schistosomules의 자세한 culturing에 대한 정보 NIAID Schistosome 리소스 센터 (에서 찾을 수에 의해 설명되어 있습니다 www.schisto - resource.org ).
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 E. 졸리에게 제공되는 케이스 웨스턴 리저브 대학 시작 기금에 의해 투자되었다. 감염된 달팽이는 Schistosome 리소스 센터, NIH - NIAID (NIAID 계약 번호 HHSN272201000009I)에 의해 제공되었다. 우리는 또한 감염된 schistosome 달팽이 확보의 지원과 도움이 토론을 위해 크리스 킹과 로널드 블랜턴 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 22g X 2-7/8 "Emulsifying 바늘 | 피셔 사이 언티픽 | 14-825 - 17G | |
| RPMI 1640 중간 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) 열 inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing 접시 (100mm) | 피셔 사이 언티픽 | 08 - 741D | |
| 범용 족집게 | 피셔 사이 언티픽 | 10 - 316C | |
| 염수 새우에 대한 페트코 수족관 NET | 페트코 | SKU : 1190954 |
참고문헌
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