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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. P0-P2 마우스 뇌 제거
- 시술을 시작하기 직전에 여러 페트리 접시에 차갑게 식힌 탄산소화 자당 인공 뇌척수액(sACSF)을 채웁니다. 또한 수집 튜브에 ~25mL sACSF를 채웁니다.
- 출생 후 0-2일(P0-P2) 강아지를 파라필름이나 장갑으로 싸서 얼음 아래에 잘 덮습니다. 타이머를 5분으로 설정하고 시작합니다. 그 후 강아지를 제거하고 뒷발을 꼬집어도 반응하지 않는지 확인하십시오.
- 강아지의 목을 베고 sACSF로 채워진 페트리 접시에 머리를 모으십시오. 정중선을 따라 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다.
- 후뇌/척수에서 두개골의 구멍을 찾아 두개골의 등쪽 부분을 따라 집게의 한쪽 끝을 삽입합니다. 정중선에서 두개골을 부드럽게 잡고 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 조각을 옆으로 '벗겨내' 뇌를 노출시킵니다.
- 두개골의 등쪽과 측면 부분을 제거한 후 집게나 주걱을 사용하여 뇌의 복부 표면 아래를 퍼서 두개골에서 뇌를 부드럽게 제거하고 어떤 부위도 손상시키지 않도록 합니다. 탄소화 sACSF로 채워진 다른 페트리 접시에 뇌를 넣습니다. 메모: 우리는 해마, 선조체 및 피질을 해부하기 위한 두 가지 다른 전략을 제시합니다. 첫 번째 전략(단계 2.1-2.10)은 모든 마우스 계통에 유용한 반면, 두 번째 전략(단계 3.1-3.7)은 선조체를 담창구 및 기타 뇌 구조에서 깨끗하게 분리하기 위해 형광 리포터 마우스가 필요합니다. 선조체가 바람직하지 않은 경우 두 기술의 선조체 특정 부분을 무시
하십시오
2. 선조체, 해마 및 피질 수확, 기술 #1
전체 뇌를 절
- 편 매트릭스 몰드에 놓고 복부면이 위로 향하도록 합니다. 면도날 1개를 뇌의 가장 앞쪽 부분(전방 후각관을 통해)에 놓습니다.
- 첫 번째 면도날의 바로 뒤쪽에 다른 면도날을 삽입하여 0.5mm 슬라이스를 생성하고 이 면도날 뒤쪽에 추가 면도날을 배치합니다.
- 이 조각을 탄소화 sACSF가 있는 페트리 접시에 옮기고 나머지 뇌는 sACSF가 있는 별도의 접시에 넣습니다. 선조체 절편을 해부 내시경으로 옮겨 선조체를 시각화합니다. 이 슬라이스는 전방 선조체의 많은 부분을 포함해야 하며 해마가 없어야 합니다. Nkx2.1-Cre+/-와 함께 형광 해부 스코프를 사용하십시오. Ai9+/- 슬라이스를 사용하여 약한 선조체 tdTomato 신호와 담창구의 강한 tdTomato 신호를 구별합니다.
- 형광이 있든 없든 모든 절편의 양쪽 반구에서 선조체를 꼬집고 선조체 덩어리를 sACSF로 적절하게 표지된 50mL 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
- 겸자나 면도날을 사용하여 정중선을 따라 뇌를 반얘기하고 내측 표면이 위를 향하도록 반구를 놓습니다.
- 복부 뇌 조직(시상, 기저핵 등)을 집게로 꼬집어 제거합니다. 완료되면 해마(등쪽 피질을 따라 전후축을 가로지르는 소시지 모양의 구조)와 피질의 심실 쪽이 명확하게 보여야 합니다.
- 해마를 제거하려면 겸자의 끝을 전방 해마 앞에 삽입하고 겸자를 뒤쪽으로 움직이고 해마-피질 경계를 따라 꼬집어 해마를 피질에서 부드럽게 분리합니다. 분리된 해마를 sACSF가 있는 적절하게 라벨링된 50mL 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
- 피질을 해부하려면 반절제된 피질 내측을 아래로 향하게 합니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 피질의 가장 등쪽, 복부, 전방 및 후방 부분을 꼬집어 내측 체감각 피질의 정사각형 덩어리(~2mm x 2mm)를 남깁니다. 필요한 경우 내측이 위로 향하도록 피질을 뒤집고 내측 표면의 과도한 비피질 조직(시상, 기저핵 등)을 깨끗하게 합니다. 피질 덩어리를 sACSF가 있는 적절하게 라벨링된 50mL 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
- 다른 반구에 대해 절차를 반복하여 해마와 피질 영역을 모두 수집합니다.
- 모든 새끼에 대해 이 절차를 반복하고 새끼 사이의 페트리 접시에 있는 sACSF를 교체하여 sACSF가 차갑고 신선하게 유지
되도록 합니다.
3. 선조체, 해마 및 피질 수확, 기술 #2
- sACSF가 포함된 실가르드 코팅 페트리 접시에 뇌 복부 쪽을 아래로 향하게 놓고 소뇌와 전피질 또는 후각 구근을 통해 고정합니다.
- 한쪽 반구부터 시작하여 구부러진 겸자를 사용하여 후방 피질을 밑에 있는 해마 및 기타 조직에서 부드럽게 분리합니다. 껍질을 벗긴 피질을 페트리 접시 위에 부드럽게 평평하게 놓습니다. 다른 반구에 대해 반복합니다. 해마와 선조체는 노출된 뇌에서 명확하게 보여야 합니다.
- 집게를 사용하여 정중선에서 한쪽 해마를 꼬집고 해마를 옆으로 벗겨 제거합니다. 얼음 위의 수집 바이알에 넣고 다른 해마와 함께 반복합니다.
- 선조체의 경우 선조체의 가장자리를 부드럽게 긁어 주변 조직에서 선조체를 풀어줍니다. 그런 다음 선조체를 아래에서 꼬집어 제거하고 얼음 위의 수집 튜브에 추가합니다. 다른 선조체에 대해 반복합니다.
- 피질 절편은 2.8단계에서 설명한 대로 채취할 수 있습니다.
- 형질전환 리포터 마우스 라인(예를 들어, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP 등), 선조체를 sACSF가 있는 페트리 접시로 옮기고 형광 해부 스코프에서 관찰합니다. 겸자를 사용하여 선조체에서 비선조체 조직을 제거합니다(Nkx2.1-Cre; Ai9 마우스는 선조체에 비해 내측 신경절 융기 또는 MGE 유래 tdTomato+ 세포 밀도가 훨씬 더 높기 때문에 모든 '밝은' 조직을 제거합니다. 모든 선조체에 대해 반복합니다.
- 모든 새끼에 대해 이 절차를 반복하고 새끼 사이의 페트리 접시에 있는 sACSF를 교체하여 sACSF가 차갑고 신선하게 유지
되도록 합니다.
4. 단일 세포 해리 생성
- 해부가 완료된 후, 10mg 프로나아제의 무게를 측정하고 10mL의 탄산소화 sACSF에 용해시켜 1mg/mL 프로나제 용액을 준비합니다.
- 50mL 수집 바이알에서 2mL의 Pronase-sACSF 용액이 들어 있는 5mL 둥근 바닥 튜브로 조직을 옮깁니다. 실온에서 20분 동안 조직을 배양하고, 배양하는 동안 손가락으로 튜브를 3-4회 흔들거나 튕겨 샘플을 혼합합니다.
- 이 배양 동안 재구성 용액을 준비합니다: 10mL 탄산소화 sACSF에 1% 소 태아 혈청(FBS, 100μL) + DNAse(1:10,000 스톡 DNAse 1μL).
- 20분 후, 바닥의 조직을 방해하지 않도록 프로나제 용액을 조심스럽게 제거하고 1-2mL의 재구성 용액으로 교체합니다(총 부피는 조직의 시작 양에 따라 다름).
- 이전에 준비된 불 연마 파스퇴르 피펫으로 조직을 분쇄하여 조직을 기계적으로 해리시킵니다. 대구경(~600μm) 피펫으로 시작하여 조직 용액을 최소 10회 흡인하고 배출하여 조직을 분해합니다. 용액에 기포를 넣지 마십시오. 중구경 피펫과 소구경 피펫에 대해 이 과정을 반복합니다. 용액은 탁해야 하며 수집 튜브에 투명한 조직 조각이 보이지 않아야 합니다.
- 세포 용해물 용액을 50μm 필터를 통해 5mL 원추형 튜브에 피펫팅하여 세포 덩어리를 제거합니다. 이러한 단일 세포 용액을 사용하여 유세포 분석을 진행합니다(또는 분류가 필요하지 않은 경우 잠재적으로 직접 세포 계수).
5. 이식을 위한 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 정제 세포 용액 준비
- 유세포 분석기에서 세포 용액을 받은 후 용액을 하나(또는 다개) 1.5mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 500g에서 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 원심분리 후 ~20-40μL가 튜브에 남아 있도록 배지를 제거합니다. 이 남은 배지에서 세포를 재구성합니다(여러 튜브가 필요한 경우 용액을 결합합니다).
- 파라필름의 작은 조각에 세포 용액 2μL + sACSF 8μL + 트리판 블루 염색 염색 10μL를 함께 혼합합니다. 슬라이드 커버가 있는 혈구계에 10μL를 피펫팅합니다.
- 표준 실험실 핸드 집계 카운터(죽은 세포는 염료로 인해 파란색이 됨)를 사용하여 혈구계 모서리에 있는 4 x 4 정사각형 격자 각각의 살아있는 세포 수를 계산하고 이 4개의 카운트를 평균화합니다. 이 숫자에 100을 곱하여 μL당 세포 수를 결정합니다.
- 필요한 경우 세포가 재구성 용액에서 10,000-30,000 세포/μL의 농도가 되도록 부피를 조정합니다. 최종 농도는 세포의 총량과 원하는 이식 횟수에 따라 다릅니다. 이식을 위해 세포를 얼음 위에 보관하십시오
6. P0-2 WT 새끼에게 이식
- 야생형(WT) 강아지를 파라필름이나 장갑으로 싸서 얼음 아래에 잘 덮습니다. 타이머를 5분으로 설정하고 시작합니다. 그 후 강아지를 제거하고 뒷발을 꼬집어도 반응하지 않는지 확인하십시오.
- 강아지가 얼음 위에 있는 동안 세포 용액을 여러 번 피펫팅하여 혼합하여 세포 현탁액이 로딩 전에 잘 혼합되었는지 확인합니다(주사할 때마다 마이크로피펫을 로딩하기 전에 세포를 혼합하십시오). 그런 다음 마이크로피펫에서 미네랄 오일을 비우고 세포 현탁액으로 완전히 채웁니다.
마- 취된 강아지를 머리를 접착 퍼티 위에 눕히고 머리 꼭대기가 비교적 평평해지도록 페트리 접시 위에 놓습니다. 강아지의 머리를 가로질러 다이아몬드 구멍이 있는 테이프를 놓고 팽팽하게 당겨 피부가 늘어나고 머리가 단단하지만 마우스가 편안하고 호흡이 잘 되도록 합니다. 람다가 다이아몬드 구멍을 통해 보여야 합니다.
- 고정된 강아지를 Nanoject 아래로 옮기고 마이크로피펫의 끝이 람다 바로 위에 오도록 마이크로피펫을 내립니다. 조작기에 x-y 좌표를 기록합니다.
- 매니퓰레이터 손잡이를 조정하여 마이크로피펫을 머리의 내외측 및 전후 축을 따라 원하는 좌표로 이동합니다: 일차 체감각 피질 또는 S1 피질 → 전방 1.0mm 및 측면 1.0mm, 해마 → 전방 0.75-1.0mm 및 측면 1.0-1.2mm, 선조체 → 전방 2.0-2.2mm 및 측면 1.5mm. 새끼의 나이(예: P0 대 P2) 또는 마우스의 계통(예: CD1 마우스가 P2에서 C57/B6보다 크음)을 보상하기 위해 좌표를 약간 조정할 수 있습니다.
- 마이크로피펫이 피부에 작은 오목한 부분을 형성할 때까지 내립니다. 그런 다음 z축 조작기 손잡이를 단단하지만 부드럽게 돌려 마이크로피펫이 피부와 두개골을 통해 뇌로 들어가도록 합니다. 마이크로피펫이 뇌에 들어가면 두개골에 가해지는 압력이 풀리고 오목한 부분이 사라집니다.
- 팁이 텐트 모양의 원뿔형 피부로 둘러싸일 때까지 마이크로피펫을 약간 집어넣습니다. z축을 따라 좌표를 읽습니다. 이것은 z축 영점이 됩니다.
- 마이크로피펫을 원하는 깊이로 내립니다: 피질 → 0.75-1.0mm, 해마 → 1.2-1.5mm, 선조체 → 2.0-2.5mm. 강아지의 나이나 긴장을 보상하기 위해 깊이를 약간 조정할 수 있습니다.
- 위에서 설명한 Nanoject III 프로그램을 사용하여 세포 현탁액을 주입합니다. 주입 프로그램이 완료된 후 15-20초를 기다렸다가 마이크로피펫을 천천히 집어넣어 주사 부위에서 용액이 누출되는 것을 최소화합니다.
- 양측 주사를 수행하는 경우 람다 위의 마이크로피펫을 다시 영점 조정하고 다른 반구의 적절한 좌표로 이동합니다. 또는 첫 번째 주사의 1mm 앞쪽으로 마이크로피펫을 움직여 동일한 반구의 피질에 두 번 주사할 수 있습니다.
- 이식이 완료되면 테이프를 제거하고 강아지를 가열 패드에 옮깁니다. 필요한 경우 꼬리나 발가락 깎기로 강아지에게 태그를 붙입니다. 강아지가 다시 붉은 색을 띠고 움직이면 어미와 함께 새장에 다시 넣습니다.