감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 마우스 등근 신경절의 전기천공 매개 형질감염

초록

출처: Li, Q. et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 축삭 재생을 연구하기 위해 마우스 DRG 뉴런의 전기천공 매개 형질감염을 보여줍니다. DRG 뉴런에 핵산 구조물을 전달하고, 좌골 신경 손상을 유도하고, 축삭 재생을 평가하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 후근 신경절(DRG) 주사
   1. DRG 주사 전 마취 유지를 위해 마취액(최종 농도 20mg/mL의 멸균 식염수에 희석된 아베르틴, 아베르틴 200mg/kg 체중)을 복강 내 주입합니다.
   2. 데옥시리보핵산(DNA) 플라스미드 또는 리보핵산(RNA) 올리고(DRG당 1μL)를 유리 모세관 피펫에 로드합니다.
   3. 모세관 유리 피펫의 끝을 DRG에 조심스럽게 삽입합니다.
   4. 세포내 미세 주입 디스펜스 시스템(30psi, 8ms)을 사용하여 DNA 플라스미드 또는 RNA 올리고의 1.0μL 용액을 DRG에 점차적으로 주입합니다.
      참고: 주사 시간은 5분 이상 지속되어야 합니다.
2. Electroporation
   1. 전극 끝에 인산염 완충 식염수(PBS)를 떨어뜨립니다.
   2. 멸균된 사각 면 거즈로 출혈을 청소하십시오.
   3. 전극으로 대상 DRG를 부드럽게 꼬집고 전기천공 시스템으로 5개의 정사각형 전기 펄스를 적용합니다.
   4. 각각 5-0 나일론 봉합사로 근육층과 피부층을 봉합합니다.
   5. 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 완전히 회복할 때까지 세심한 주의를 기울여 가열된 담요(35.0°C) 위에 마우스를 놓습니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복된 후 홈 케이지로 되돌립니다.
      참고: 마우스가 37°C 담요에서 마취에서 완전히 회복되는 데 약 60분이 걸립니다. 이부프로펜 1알(200mg)을 물 1,000ml(0.2mg/ml)에 녹여 매일 수유하여 수술 후 통증을 완화합니다.
3. 좌골 신경 압착
   1. DRG 전기천공 후 2-3일(실험 설계에 따라 다름) 마취액(아버틴 400mg/kg 체중 사용)으로 마우스를 복강내 마취합니다.
   코
   2. 르크판에 쥐의 네 팔다리를 테이프로 붙입니다.
   3. 정중선을 따라 왼쪽으로 1cm 0.5cm 절개합니다. 대둔근과 이상근과 같은 근육을 세로로 자릅니다. 대좌골공과 좌골 노치 사이의 좌골 신경 부분을 노출시킵니다.
   4. 미세수술 겸자로 12초 동안 신경을 분쇄하고 10-0 나일론 신경상막 봉합사로 압착 부위를 표시합니다. 경막막에 매듭을 만들어 압착 부위를 표시합니다.
   5. 5-0 나일론 봉합사로 근육과 피부층을 봉합합니다.
   6. 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 완전히 회복할 때까지 세심한 주의를 기울여 가열된 담요(35.0°C) 위에 마우스를 놓습니다. 마취에서 완전히 회복된 후 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
      참고: 마우스가 37°C 담요에서 마취에서 완전히 회복되는 데 약 60분이 걸립니다. 이부프로펜 1알(200mg)을 물 1,000ml(0.2mg/ml)에 녹여 매일 수유하여 수술 후 통증을 완화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ECM 830 구형파 전기천공 시스템	BTX Harvard Apparatus	45-0052	생체 내 전기천공용
Tweezertrodes 전극	BTX Harvard Apparatus	45-0524	체 내 전기천공용, 1mm 평면
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	세포내 미세 주입 디스펜스 시스템
붕규산 유리 모세관	World Precision Instruments, Inc.	1902328
실체 해부 현미경	라이카	M80
미세 수술 겸자	FST by DUMONT, 스위스	11255-20	좌골 신경 분쇄 전용
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, 표준 벽
테이프	Fisherbrand	15-901-30	코르크 보드에 마우스 고정용
2, 2, 2-트리브로모에탄올(Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin 원액
2-메틸-2-부탄올	Sigma-Aldrich	152463	Avertin 원액
siRNA 형광 범용 음성 대조군 #1	Sigma-Aldrich	SIC003	를 사용한 비표적 siRNA
Dy547을 사용한 형질감염 모방 대조	Dharmacon	CP-004500-01-05	사용한 비표적 microRNA
	Invitrogen Purelink	K210016	GFP 코딩 플라스미드 준비
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	주입 중 DRG 윤곽을 더 잘 시각화하기 위해
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	마취 유도
자일라진	AnaSed	NDC 59399-110-20	마취 유도
아세트아미노펜	McNeil 소비자 건강 관리	NDC 50580-449-36	수술 후 통증 완화

생 형광 microRNA 형광 플라스미드 준비 키트를