중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

초록

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 20% 리도카인 염산염 원액의 제조

리

1. 도카인 염산염 2g의 무게를 측정합니다. 멸균수 5-6mL를 넣고 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 멸균수로 부피를 10mL로 늘립니다.
2. 1.2 0.2미크론 필터를 통해 원액을 여과합니다. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브당 1mL를 원액으로 분취하고 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 4°C에서 보관하십시오.

2. 깨어 있는 쥐의 직접 척수강내 AAV 전달

1. 70% 에탄올이 함유된 멸균 거즈를 사용하여 작업 영역을 닦고 필요한 소모품을 준비합니다.
멸
2. 균 200μL 미세원심분리기 튜브에 95μL의 rAAVrh10 원액(5 x 10¹² 게놈 카피/mL)을 첨가하여 100μL의 AAVrh.10/1% 리도카인 염산염 복합체를 준비하고 5μL의 20% 리도카인 염산염 원액을 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 그런 다음 바이러스 용액을 얼음(4°C)에 보관합니다.
   참고: 마우스당 8μL가 사용됩니다.
3. 주사용 AAV 용액으로 주사기 준비
   1. 27G 바늘로 25μL 해밀턴 주사기를 조립하고 바늘의 경사진 끝을 주사기의 체적 눈금에 맞춥니다.
   2. 바이러스 용액의 4 x 10¹⁰ 게놈 사본이 포함된 8 μL를 주사기에 부드럽게 끌어 넣습니다. 기포를 제거하십시오.
4. 마우스 준비
   참고: 이 연구는 수컷 또는 암컷 FVB/NJ 마우스(30-70일령)를 사용했습니다. IT 주입은 후드에서 수행되었습니다.
   1. 70% 에탄올로 후드의 작업 영역을 살균합니다. 깨어 있는 쥐(수컷 또는 암컷, 생후 30-70일, 체중 13-20g)를 후드에 엎드린 자세로 침대 위에 올려 놓습니다. 상체를 멸균 거즈로 덮어 쥐를 진정시키고 물리지 않도록 하십시오.
   2. 한쪽에는 엄지손가락을, 다른 쪽에는 검지/중지로 골반 띠를 적절하고 단단히 잡아 동물을 고정합니다. 엄지와 검지로 양측 골반 거들 사이의 피부를 팽팽하게 유지합니다. 손바닥으로 동물의 상체를 부드럽게 잡습니다.
   3. 양측 골반 거들 사이의 등 털을 면도한 다음 요오드화물 기반 스크럽과 70% 에탄올로 피부 표면을 살균합니다.
5. 척수강내 주사
   1. 다른 손의 엄지나 검지로 양측 골반 거들 사이의 중간선을 따라 추간 공간을 느끼고 손톱으로 움푹 들어간 부분을 눌러 L5-L6 추간 공간을 나타냅니다(주사 부위 찾기).
   2. 꼬리 밑부분을 약간 부드럽게 돌려 척추의 정중선을 나타냅니다. 주입하기 전에 바늘 경사를 동물의 머리 쪽으로 조정하십시오.
   3. 동물이 단단히 고정되었는지 확인하고 척추의 정중선을 따라 바늘을 정렬합니다.
   4. 주사기를 중앙 시상면에 유지하면서 움푹 들어간 부분의 교차점에 바늘을 부드럽게 수직으로(또는 약간 70-80° 기울이기) 삽입합니다. 뼈를 연결할 때 각도를 약 30°로 천천히 줄인 다음 바늘을 추간 공간으로 밀어 넣습니다.
      참고: 명백한 갑작스러운 꼬리 플릭은 경막내 공간에 성공적으로 진입했다는 신호입니다. 바늘이 추간 공간에 들어가면 바늘 끝이 단단히 고정된 느낌이 듭니다. 이 연구에 사용된 27G 바늘은 쥐의 IT 전달에 적합하지만 쥐는 적합하지 않습니다.
   5. 벡터 용액을 주입합니다. 타이머를 시작하고 1 μL/4초의 속도로 8 μL의 벡터 용액을 주입합니다. 배송이 끝난 후 약 1분 동안 바늘을 보관하십시오. 누출을 방지하기 위해 바늘을 부드럽게 회전시키면서

빼냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FVB/NJ 마우스	Charles River Laboratories China
리도카인 염산염 일수화물	HEOWNS	73-78-9
AAV	바이러스 벡터 코어 유전자 치료 센터 매사추세츠 의과대학
25μL 해밀턴 주사기/27-30g 바늘	GASTIGHT	1702
70% 에탄올	WEN ZHI
거즈	웨이 AN	5171112	8cm*10cm*12cm