마우스 모델에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막하 주사

초록

출처: Park, SW, et al. 생쥐 망막 색소 상피에서 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터의 윤부 접근법-망막하 주사. J. Vis. 경험. (2015년)

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비디오는 마우스 모델에서 망막 색소 상피(RPE)에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 방법을 설명합니다. 마취 및 눈 준비부터 정확한 렌티바이러스 벡터 전달에 이르기까지 RPE에서 유전자 통합 및 발현을 보장하는 절차를 자세히 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사 키트 및 바이러스 벡터 준비

1. 에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 멸균된 33G 무딘 바늘이 장착된 마이크로리터 주사기를 준비합니다. 마이크로튜브에서 적절한 역가(즉, 1 x 10⁶ TU/μl)를 위해 PBS(인산염 완충 식염수)에서 바이러스 벡터를 희석합니다. 주사기를 바이러스 벡터로 여러 번 세척하여 주사기의 사각지를 제거합니다.

2. 바이러스 벡터의 망막하 주사

틸

1. 레타민과 졸라제팜(1:1, 2.25 mg/kg 체중) 및 자일라진 염산염(0.7 mg/kg 체중)의 혼합물을 복강내 주사하여 성인 마우스(즉, 6 - 8주령)
를 마취합니다.
2. 페닐에프린 0.5%와 트로피카미드 0.5%의 점안액으로 동공을 확장합니다.
3. 마이크로리터 주사기에 1.5 - 2 μl의 바이러스 벡터를 로드하여 준비합니다.
4. 눈꺼풀을 열고 눈을 돌출하여 적도를 노출시켜 주사를 편리하게 합니다. 수술 현미경으로 집중하십시오. 주사가 끝날 때까지 튀어나온 눈 위치를 유지하지 않으면 주사 중에 바늘이 변위될 수 있습니다. 안구를 단단히 잡으려면 손가락을 안와 가장자리 바깥쪽에 놓습니다.
안
5. 과용 점탄성 용액 한 방울을 각막 표면에 바릅니다.
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6. 막을 시각화하기 위해 각막 상단에 작은 둥근 커버 슬라이드를 놓습니다.
7. 추가 망막하 주사를 위해 멸균 30G 1/2 바늘을 사용하여 윤부의 약간 뒤쪽에 작은 구멍을 뚫습니다. 편의상 구멍은 오른쪽 눈은 아래, 왼쪽 눈은 위쪽으로 만드십시오.
   참고: 측두부나 비강에 구멍이 뚫린 경우 주사 후 눈꺼풀이 가려지기 어렵습니다. 초기 천자는 윤부를 따라 흐르고 쉽게 인식할 수 있는 윤부 혈관을 피하기 위해 윤부에서 약간 뒤쪽으로 이루어져야 합니다. 초기 구멍을 뚫는 동안 바늘로 렌즈에 부딪히지 않도록 주의하십시오. 렌즈 펑크를 방지하기 위해 바늘의 경사를 전체적으로 삽입하지 마십시오.
8. 마이크로리터 주사기의 33G 무딘 바늘을 미리 뚫은 구멍을 통해 놓고 가벼운 저항이 느껴질 때까지 바늘을 망막하 공간으로 접근합니다.
   참고: 망막하 주사의 경우 바늘의 가장 좋은 접근 각도는 홍채면에 대해 약 45도이며, 무딘 바늘은 유두주위 영역을 향해 뒤쪽으로 밀어야 합니다. 점선 사각형은 그림 1에서 망막하 주사를 위해 유리체강을 가로지르는 제안된 바늘 경로를 나타냅니다.
   참고: 망막층은 매우 부드럽기 때문에 망막층을 뚫거나 통과할 때 저항이 느껴지지 않습니다. 따라서 가벼운 저항의 첫 번째 느낌은 바늘이 이미 RPE(망막 색소 상피) 층에 닿았음을 나타내며 바늘 삽입을 중지해야 합니다. 바늘은 잠재적인 망막하 공간에 배치해야 하므로 과도한 압력으로 공막 조직을 관통하지 않도록 주의하십시오. 바늘이 과도한 힘으로 공막 조직에 구멍을 뚫으면 저항 없이 외안와 공간으로 들어갑니다. (이 단계는 매우 중요합니다)
9. 원치 않는 조직 손상을 방지하기 위해 바이러스 벡터(예: 1 x 10⁶ TU/μl)를 떨림 없이 망막하 공간에 부드럽게 주입합니다. 그런 다음 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 2.4에 설명된 대로 주사 중에 안구를 단단히 잡으십시오.
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10. 막 출혈이 없는지 확인하기 위해 수술 현미경으로 주사 후 망막하 수포의 형성을 관찰합니다.

결과

그림 1. 망막하 주사의 개략도. H&E(헤마톡실린 및 에오신 염색) 표지된 망막하 주사를 위한 바늘 경로가 있는 구조를 묘사하는 마우스 눈의 단면(점선 사각형). 배율: 40X, 스케일 바: 500μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
핀셋 DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06mm 팁	WPI	500233
VANNAS 가위 S/S, 105mm	WPI	555583S
33G 무딘 바늘	WPI	NF33BL-2
NanoFil 주사기, 10 마이크로리터	WPI	NANOFIL
RPE-KIT	WPI	RPE-KIT	쉬운 한 손 주사
30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM 바늘	BD	305107	망막하 주사를 위한 초기 천자
미경 커버 안경 (1 번 직경 3mm)	Warner Instruments	64-0720 (CS-3R)
라이카 작동 현미경	라이카	LM M80
플루오레세센 현미경	니콘	이클립스 80i
렌티바이러스	써모 사이언티픽	TMO. LV-Ctr	벡터 희석에 사용
PBS	Gibco	10010-015	벡터 희석에 사용
Troperin (페닐에프린 0.5%-트로피카미드 0.5%)	미		확장용
프로파라카인 염산염 점안액 USP, 0.5%(멸균)	Bausch&Lomb		국소 마취용
Healon GV OVD	Abbott Medical Optics Inc.
Zoletil 50(차아염산염틸레타민 및 차아염산졸라제팜)	Virbac		전신마취용
Rompun® 주사(Xylazine HCl)	Bayer		전신마취용

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