석영 마이크로니들을 사용한 설치류 뇌 미세주사

초록

출처: Paolone, G., et al. 설치류 뇌의 미세 주사를 위한 맞춤형 바늘. J. Vis. 경험. (2018).

이 비디오는 구멍이 있는 석영 마이크로니들을 사용하여 설치류 뇌 마이크로니들 주사를 보여줍니다. 마이크로니들은 분사 속도를 제어하기 위해 주사기와 마이크로펌프에 부착됩니다. 주사액이 담긴 바늘을 전달 속도를 낮게 설정한 상태에서 뇌에 삽입합니다. 일단 배치되면 배송 속도가 빨라집니다. 잠시 멈춘 후 바늘을 빼냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 석영 바늘의 준비

석

1. 영 모세관을 증류수에 5분, 에탄올 99%에 5분, 디에틸-에테르에 5분 동안 두어 세척 및 멸균합니다( 재료 표 참조).
모
2. 세혈관을 후드 아래에 최소 1시간 동안 두어 완전히 건조시키십시오.
3. 개인의 필요에 따라 충분히 길고 충분히 얇은 바늘을 생산할 수 있는 매개변수에 따라 레이저 풀러를 사용하여 바늘을 준비합니다.
   참고: 레이저 풀러를 사용합니다( 재료 표 참조). 당기기에는 두 줄 프로그램을 사용하십시오. 첫 번째 라인은 고출력, 가장 큰 스캔 길이(FILAMENT'S VALUE에 해당) 및 당기는 힘이 없습니다. 이러한 매개변수 조합은 가장 낮은 확장 속도로 모세관의 가장 큰 부분을 녹여 내부/외부 크기가 크고 생크가 감소된 긴 바늘을 성형할 수 있도록 합니다. 이러한 방식으로 바늘은 높은 기계적 저항과 줄기 세포나 바이러스 입자가 막히지 않고 통과할 수 있는 넓은 내경을 유지합니다. 이 프로그램 라인의 속도와 지연은 팁이 너무 작고 길어지기 전에 모세관 확장을 중지하여 필요한 기계적 및 모양 특성을 놓쳐야 합니다. 당김 프로그램의 두 번째 줄은 석영이 냉각되면(5초) 자동으로 실행됩니다. 파워, 필라멘트 및 당기는 힘의 매개변수는 가능한 한 짧은 팁 길이와 가파른 생크로 팁을 절단하는 데 기능하며, 팁 파열로 인해 두 바늘이 분리되는 것을 방지합니다. 일상적으로 우리 장비에서 우리는 다음을 사용합니다: (a) 라인 1 = 전력 990, 필라멘트 5, 속도 130, 지연 110, 당김 0; (b) 라인 2 = 전력 970, 필라멘트 3, 속도 0, 지연 70, 당김 0.
4. 이전에 70% 에탄올로 세척한 페트리 접시에 바늘을 넣습니다.
   1. 접시를 플라스틱 파라핀 필름으로 덮습니다.
5. 마이크로 해부기로 모세혈관을 절단합니다.
   1. 시작할 때 레이저가 자동 보정 프로세스를 실행하여 전달된 전력과 에너지를 확인하도록 합니다. 그런 다음 절단 매개변수를 설정합니다.
      참고: 우리는 마이크로 해부기( 재료 표 참조)와 다음 매개변수를 사용합니다: 레이저 출력 펄스 에너지(63μJ), 최대 조리개의 20%의 레이저 빔 직경(최대 조리개: 1.0μm) 및 최대 속도의 10%의 절단 속도(최대 속도: 30μm/s).
   2. 바늘을 현미경 테이블에 단단히 고정하고 끝을 컴퓨터 화면 중앙에 놓습니다.
   3. 메뉴 표시줄에서 연필 아이콘을 클릭하고 이를 사용하여 바늘의 레이저 절단을 위한 표시를 그립니다.
      참고: 절단은 바늘 표면에 대해 약 45° 각도여야 합니다.
   4. 사이드바 기능에서 "START CUT" 버튼이 포함된 플래그를 선택하여 레이저가 이전에 표시된 지점을 절단할 수 있도록 합니다.
   5. 필요한 경우 1.5.2-3에 설명된 절차를 반복하여 측면 구멍을 자릅니다. 바늘의 위치를 변경할 필요가 없습니다(그림 1).
6. 절단 후 청소.
   1. 플라스틱 튜브를 통해 바늘을 보이드 펌프에 연결합니다.
   2. 펌프를 켜고 적당한 속도(3μL/min)로 순방향 유량을 수동으로 설정합니다.
   3. 99% 에탄올을 먼저 흡인한 다음 증류수를 흡인하여 절단으로 인한 불순물을 제거합니다.
   4. 건조를 용이하게 하기 위해 99% 에탄올을 다시 흡인합니다.
      참고: 각 단계는 최소 3분 동안 지속되어야 합니다.
7. 수술 당일까지 바늘을 적절하게 덮은 페트리 접시에 보관하십시오.
8. 바늘은 재사용할 수 있습니다. 실험이 끝나면 표백제와 에탄올로 세척하여 용액과 가능한 조직 잔여물을 제거합니다. 보다 완전한 세척을 위해 팁이 아래를 향하도록 마이크로피펫 보관 용기에 바늘을 넣고 팁이 덮일 때까지 용기에 증류수를 채우고 1.5분 동안 끓여서 남은 조직을 제거한 다음 에탄올로 세척합니다.

2. 절차

1. 펌프 사용 설명서에 제공된 지침에 따라 설정 메뉴를 선택하여 미세 주입 주사기의 직경/부피에 따라 펌프를 교정하고 유량을 0.3μL/min으로 설정합니다.
2. 뭉툭한 바늘(예: 해밀턴 바늘, 30G)과 짧은 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브가 장착된 10mL 주사기에 멸균수를 채우고 이를 사용하여 미세 주입 주사기(피스톤을 매우 조심스럽게 제거한 후) 및 수동 미세 주입 펌프(MMP)용 주입 어셈블리 부품 키트를 채웁니다.
   참고: MMP 키트는 정위 프레임에 바늘을 단단히 장착하는 데 사용됩니다(그림 2). 이 키트에는 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브, 루어-튜빙 커플러, 피펫 홀더 및 외경이 다른 피펫용 개스킷이 포함되어 있습니다.
3. 바늘을 MMP 키트에 연결합니다.
   1. 10mL 주사기를 통해 시스템 전체에 더 많은 물을 씻어내고 바늘에서 물이 나오는지 확인합니다.
      참고: 충전 단계를 반복하여 시스템 내부의 기포를 제거해야 합니다.
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4. 세 주입 주사기 상단에 물 한 방울을 남기기 위해 피스톤을 천천히 밀면서 미세 주입 주사기에서 10mL 주사기를 분리합니다. 미세 주입 주사기에 피스톤을 삽입합니다.
5. 미세 주입 주사기를 펌프에 연결하고 유속을 0.3 μL/min으로 설정합니다.
   참고: 바늘 끝에서 방울이 새어 나올 때까지 기다렸다가 3분 더 그대로 둡니다.
6. 유량을 0.1μL/min으로 설정하고 수술 절차를 시작합니다. 수술을 수행하는 동안 펌프가 작동해야 합니다.
   참고: 이 기사에 보고된 실험을 위해 300g(생후 3개월)의 수컷 Sprague Dawley 쥐를 사용합니다. 그러나 이 절차는 다른 종, 특히 생쥐에 적용할 수 있습니다.
7. 현지 규정에서 승인한 방법을 사용하여 전신 마취를 유도합니다.
   참고: 20-50분의 마취 동안 85mg/kg 케타민과 8mg/kg 자일라진의 복강내 주사(ip)를 혼합하여 사용합니다. 꼬리 및/또는 발가락을 꼬집어 동물이 완전히 진정되도록 하는 것이 중요합니다. 마취 수준과 기본 바이탈은 수술 시작 전에 평가되고 수술을 수행하는 동안 10분마다 모니터링됩니다. 동물의 체온은 물 재순환 가열 패드를 사용하여 수술 전, 수술 중, 수술 후에 일정하게 유지됩니다. 동물은 완전히 회복될 때까지 모니터링됩니다(예: 똑바로 서 있고 걸을 수 있습니다). 또한 동물은 수술 후 3일 동안 24시간마다 진통제(트라마돌, 5-7mg/kg i.p.)를 투여받습니다.
   1. 동물의 머리를 면도하고 무균 수술을 위해 수술 부위를 적절하게 준비하십시오. 요오드 기반 용액(베타딘)과 70% 에탄올로 2단계 스크럽을 수행합니다. 또한 무균을 유지하려면 수술 부위를 수술용 드레이프로 감싸십시오(비디오에서는 시연 목적으로 생략됨).
8. 쥐를 정위 고정 프레임에 물 재순환 가열 담요 위에 놓습니다. 추가적인 통증 완화를 위해 수술 부위에 0.5% 리도카인 용액(7mg/kg을 초과하지 마십시오)을 도포하십시오. 비드 멸균기 또는 액체 저온 소독을 사용하여 장비를 2% 글루타르알데히드와 7.05% 페놀(Sporodicin 또는 Cidex)에 담근 다음 멸균수 또는 식염수로 헹구어 모든 수술 기구를 사전 멸균합니다. 소독은 시술 사이에도 수행해야 합니다. 멸균된 메스를 사용하여 두개골을 세로로 절단합니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 부드럽게 하십시오. 납작한 주걱을 사용하여 두피를 열고 피부 플랩에 수술용 클립을 부착하여 열린 상태를 유지합니다. 매우 부드럽게 골막을 분리하여 바늘이 삽입될 두개골 부위와 브레그마를 노출시킵니다.
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9. 을 정위 고정 프레임에 장착하고(흐름이 진행되는 동안) 바늘 끝을 브레그마 위로 정확히 이동시키면서 끝이 부러지지 않도록 주의합니다. bregma의 전후 및 중외측 좌표에 주석을 달고 원하는 좌표로 변환합니다. 입체 현미경의 안내에 따라 바늘 끝이 두개골에 거의 닿을 때까지 바늘을 내리고 정위 팔을 약간 올린 후 드릴링 지점을 표시합니다.
10. 드릴(드릴 팁 Ø: 0.8mm, 드릴 속도: 1,000rpm) 표시된 지점에 두개골을 뚫습니다. 드릴링 절차 중에 경막을 관통하지 않도록 주의해야 합니다. 드릴링하는 동안 뼈 손상 및 괴사를 방지하기 위해 멸균 식염수를 떨어뜨립니다.
11. 플라스틱 파라핀 필름의 작은 조각을 잘라 두개골에 놓습니다. 10μL 피펫을 사용하여 용액을 한 방울로 떨어뜨려 플라스틱 파라핀 필름에 주입합니다. 펌프를 멈추고 펌프의 푸셔를 살짝 회수한 다음 미세 주입 주사기의 피스톤을 부드럽게 당겨 모세관에 약간의 기포를 만듭니다.
12. 바늘 끝이 방울에 닿을 때까지 정위 암을 내립니다. 미세 주입 주사기의 피스톤을 (매우 천천히) 당겨 샘플을 추출하여 기포 형성을 피합니다. 피스톤과 접촉한 펌프 푸셔를 교체하고 0.3μL/min의 유속으로 펌프를 켭니다. 다음 단계로 진행하기 전에 방울이 형성될 때까지 기다리십시오(몇 분).
    참고: 본 예시 실험에서 선조체에 인공 뇌척수액(aCSF)을 주입했습니다[AP(전후방): +1.5, ML(내외측): ±2.7; DV(배복부): -5.0] 및 등쪽 해마(AP: -3.5, ML: ±2.1; DV: -3.5; 경막에서 mm 단위), 2 μL/부위. 두 주사 방법 간의 비교를 용이하게 하기 위해 한쪽 반구에는 석영 바늘을 사용하고 다른 반구에는 26G 뭉툭한 팁 또는 30G 경사진 끝 스테인리스 스틸 바늘을 사용하여 각 뇌 영역을 주입했습니다.
13. 유량을 0.1μL/min으로 낮추고 스테인리스 스틸 베벨 팁 바늘로 경막에 흠집을 낸 다음 배복부 도끼의 정위 암을 천천히 내려 뇌 조직으로 들어갑니다. 원하는 위치에 도달하면 0.1mm 더 내려가 펌프를 멈추고 정위 암을 0.1mm 올린 다음 0.3μL/min의 흐름으로 펌프를 다시 시작합니다.
    참고: 바늘을 내리는 동안 느린 흐름을 유지하는 이유는 바늘 자체에 작은 조직 조각이 침투하는 것을 방지하는 양압을 보장하기 위해서입니다. 이러한 이벤트는 팁을 방해하여 용액 전달을 손상시킵니다. 바늘을 내리는 동안 유속이 매우 느리고 내리는 속도가 약 10s/mm이기 때문에 이는 바늘 트랙을 따라 남아 있는 용액의 양이 표적 부위에 주입된 용액에 비해 무시할 수 있음을 의미합니다. 이 예방 조치는 측면 구멍이 있는 바늘을 사용할 때 피할 수 있습니다.
14. 타이머를 시작하고 주입할 원하는 부피에 따라 필요한 시간을 기다립니다(예: 2μL를 주입하는 경우 6분 40초). 주입하는 동안 기포의 움직임을 모니터링합니다. 마지막에 펌프를 멈추고 5분 정도 기다렸다가 천천히 바늘을 꺼냅니다. 석영 바늘이 완전히 추출되면 펌프를 다시 시작하고 바늘 끝에 방울이 형성되는지 확인하십시오.
15. 두개골 표면의 구멍을 뼈 왁스로 밀봉하고 지혈 클립을 제거하고 두피를 봉합한 다음 상처 주변을 항생제 크림(예: 네오스포린)으로 코팅한 다음 동물을 집 케이지로 돌려보냅니다.

결과

그림 1: 석영 바늘 끝의 현미경 이미지로, 유체 주입에 사용되는 팁과 구멍의 다양한 직경을 보여줍니다. (A)의 저배율 사진과 (B)와 (C)의 고배율. 바늘은 (B) 및 (C)에 도시된 바와 같이 뇌 영역의 해부학적 구조, 확산 목표 및 용액의 점도에 따라 다른 방식(다른 길이, 구멍 수 및 구멍 치수)으로 준비될 수 있습니다. 저전력 레이저 미세 해부를 사용하여 얻은 구멍과 팁의 매끄러운 절단을 확인하십시오.

재료