공초점 현미경을 이용한 면역표지 성상세포의 3차원 이미징

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 동물, 수술 및 표본 준비

참고: 3차원(3D) 공초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다.

1. 동물을 무작위로 두 그룹으로 나눕니다: 아밀로이드 베타(Aβ)_1-40\u2012주사(n = 8) 및 제니스테인 처리를 통한 Aβ_1-40\u2012 주사(n = 8); 수술 1시간 전에 강황으로 제니스테인(폴리에톡실화 피마자유와 같은 비히클에서 희석된 10 mg/kg)을 투여합니다.
2. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)으로 동물을 마취합니다. 발가락을 꼬집은 후 금단 반사가 없어 적절한 마취를 확인하십시오. 건조함을 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용하십시오.
3. 동물을 정위 고정 장치에 넣고 머리를 면도하십시오. 절개 전 요오드 용액을 바르고 수술 중 수술 부위를 멸균 상태로 유지하여 감염 위험을 줄입니다. 쥐 뇌 아틀라스에 따르면 Aβ_1-40을 정위 정위적으로(4μl) 해마에 정위 정위적으로(4μl) 주입하여 머리바 후 -3.5mm, 정중선 측면 ± 2mm, 경막 아래 -2.8mm에 주입합니다.
4. 동물의 편안함을 보장하기 위해 동물이 완전히 의식이 있을 때까지 수술 후 관찰/관리를 제공합니다. 회복하는 동안 동물을 따뜻하게 유지하고 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 케이지에 돌려보내지 마십시오. 수술 후 동물의 감염 징후에 주의하십시오.
5. 수술 3주 후 케타민(150mg/kg)으로 동물을 깊숙이 마취합니다. 0.9% 식염수로 동물을 관류한 다음 0.1M 인산염 완충 식염수 또는 PBS(pH = 7.4)에 4% 파라포름알데히드를 관류하여 경심 고정을 수행한 다음 뇌를 제거하고 고정합니다.
6. 4°C에서 2-3일 동안 4% 파라포름알데히드에 뇌를 고정합니다.
7. 조직 포매 장비를 사용하여 파라핀 블록에 조직을 포획하고 올바른 정렬 또는 절편을 방해할 수 있으므로 카세트를 과소 채우거나 과도하게 채우지 마십시오. 파라핀 블록의 조직 방향에 주의하십시오.
   참고: 예를 들어, 쥐 해마는 대뇌 반구의 뒤쪽 부분에 가깝습니다. 따라서 조직은 절편이 뇌의 뒤쪽 부분에서 시작되는 방식으로 매립되어야 합니다. Paxinos 아틀라스를 가이드로 사용하여 원하는 해부학적 구조에 도달하십시오.
8. 공기 이동으로 인해 섹션 처리가 어려워지므로 미크로톰을 공기 통풍이나 출입구에서 멀리 떨어뜨리십시오.
9. 이 깊이는 완전한 성상세포의 Z-Stack 이미지를 생성하는 데 필요하므로 두께가 ≥20μm인 절편을 사용하십시오. 처음 몇 개의 섹션은 열팽창으로 인해 원하지 않는 두께를 가질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
절
10. 편을 평평하게 만들 수 있을 만큼만 긴 따뜻한 물(5 ± 2°C, 파라핀의 용융 온도보다 낮음) 표면에 절편을 놓습니다.
    참고: 단면을 과도하게 팽창하면 구조의 형태를 방해할 수 있습니다. 작은 붓을 사용하여 섹션을 조심스럽게 옮깁니다. 각 슬라이드에서 두세 개의 섹션을 수집합니다.
11. 슬라이드를 직립 랙에 보관하고 37°C에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다(O/N).

2. 면역조직화학

1. 일렌에서 절편을 2 x 10분 동안 탈파라핀화하고 알코올 구배(각각 99.8%, 95%, 70%, 10분)와 PBS를 통해 재수화합니다.
2. 0.25% 소 혈청 알부민(BSA), 0.25% Triton X-100 및 3.5% 정상 혈청(4°C에서 O/N)을 포함하는 PBS에서 1:1,500으로 희석된 신경교 섬유산성 단백질(GFAP)에 대한 항체와 함께 배양합니다.
3. PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
4. 2차 알칼리성 인산염 접합 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다(1:100, 21°C, PBS로 희석).
5. PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
   참고: 배경 염색을 최소화하기 위해 2차 항체 후 절편을 적절하게 세척하는 것이 중요합니다.
6. 액체 영구 적색 발색원(15-20분)과 함께 어두운 곳에서 절편을 배양합니다.
   참고: 사용하기 30분 이내에 용액을 준비하십시오.
7. PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
8. 마지막으로, 커버 슬립 전에 4-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 1:500, PBS로 희석)으로 핵을 염색합니다. 현미경 검사 전에 슬라이드를 냉장고에 24-48시간 동안 보관하십시오.

3. 공초점 현미경 참고

: 정량적 평가(아래 참조)를 위해 오류 위험을 줄이기 위해 최소한의 겹치는 가지가 있는 명확하게 보이는 DAPI 염색 핵이 있는 성상세포를 선택하십시오. Z-Stack 이미지를 생성하는 데는 시간이 많이 걸립니다. 인내심을 갖고 처리 중에 멈추지 마십시오. 직립 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 성상 세포의 3D 이미지를 만드는 데 사용됩니다.

1. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 63X 대물렌즈를 선택합니다.
2. 이미징 소프트웨어를 열고 시스템 시작을 클릭합니다. 찾기 탭을 클릭합니다. 할당으로 이동하여 GFP를 선택하여 적절한 조명을 조정합니다.
3. 셔터를 열어 빛을 반사합니다. 셔터 오른쪽에서 반사경 리볼버를 찾아 성상세포에 의해 반사되어야 하는 색상(녹색, 빨간색 또는 보라색)을 선택합니다. 여기에는 빨간색(FSet20 wf)이 사용되었습니다.
   참고: 현미경의 안구에 직접 사진의 초점을 맞추는 것을 잊지 마십시오.
4. 최상의 초점을 찾으려면 모두 닫힌 것을 클릭하고 현미경 핀을 화면 모드로 전환한 다음 획득 탭을 클릭합니다.
5. Acquisition(획득) 탭에서 Smart Setup(스마트 설정)을 클릭하면 창이 열립니다. 목록에서 적절한 형광단(예: 현재 프로젝트의 DAPI 및 Alexa Fluor 555)을 선택합니다. 색상이 자동으로 선택됩니다.
6. Best Signal 및 Apply를 클릭한 다음 Set Exposure를 클릭합니다. 그러면 컴퓨터가 자동으로 노출 매개변수를 설정합니다.
7. 이미지를 최적화하려면 채널 창으로 이동합니다. Track2 표시를 해제하고 Track1을 강조 표시한 다음 라이브를 클릭합니다. 필요한 경우 이미지에 초점을 맞춥니다.
8. 채널 창에서 다음 키를 조정합니다. 핀홀을 자동으로 최적화하려면 1AU를 클릭합니다. 이 단계를 수행하는 것이 매우 중요하며 그렇지 않으면 공초점 이미지가 최적이 아닙니다. 최상의 강도를 갖도록 게인을 조정합니다(추가 노이즈를 줄이려면 이 설정을 800 미만으로 유지). 마지막으로 디지털 게인을 2에서 3 사이로 설정합니다.
9. Track1 표시를 해제하고 Track2를 클릭한 다음 Track2에 대해 3.8단계를 반복합니다. 그런 다음 라이브를 중지하십시오.
10. 획득 모드 창으로 이동합니다. 프레임 크기 및 평균화를 최적화하여 이미지를 개선합니다. 프레임 크기를 변경하려면 X*Y로 이동하여 1,024 x 1,024를 선택합니다. 더 나은 이미지를 만들려면 느린 속도를 선택하십시오.
평
11. 균으로 이동하여 숫자 ≥4를 선택합니다. 이 평균 값은 획득한 이미지를 생성하기 위해 평균화될 스캔 수를 나타냅니다. 이제 스냅 버튼을 클릭하고 캡처한 2D 이미지를 저장합니다.
12. 3D 이미징의 경우 스마트 설정 아래에서 Z-Stack 항목을 표시하여 Z-Stack 창이 열립니다.
13. Z-Stack의 첫 번째 및 마지막 위치, 즉 셀의 깊이를 설정합니다. 먼저 라이브를 클릭합니다. 그런 다음 현미경의 초점 드라이브를 사용하여 Z-Stack이 시작되는 조직에서 성상세포의 최위 위치에 초점을 맞춥니다. 먼저 설정을 클릭합니다. 그런 다음 Z-Stack 스캔을 중지해야 하는 조직에서 성상세포의 가장 낮은 위치로 초점을 맞춥니다. 마지막으로 설정을 클릭합니다. 그런 다음 라이브를 중지하십시오.
14. 간격을 선택합니다. 현재 연구에서는 1.01 μm가 사용되며, 간격을 선택하려면 최적을 클릭하여 슬라이스 수를 설정할 수 있습니다.
15. 실험 시작을 클릭합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 이 이미지는 성상세포 영역의 표면적 및 부피뿐만 아니라 가지, 세포체 및 핵을 포함한 전체 성상세포와 같은 매개변수를 측정하는 데 사용됩니다.