$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 동물, 수술 및 표본 준비
참고: 3차원(3D) 공초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다.
- 동물을 무작위로 두 그룹으로 나눕니다: 아밀로이드 베타(Aβ)1-40\u2012주사(n = 8) 및 제니스테인 처리를 통한 Aβ1-40\u2012 주사(n = 8); 수술 1시간 전에 강황으로 제니스테인(폴리에톡실화 피마자유와 같은 비히클에서 희석된 10 mg/kg)을 투여합니다.
- 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)으로 동물을 마취합니다. 발가락을 꼬집은 후 금단 반사가 없어 적절한 마취를 확인하십시오. 건조함을 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용하십시오.
- 동물을 정위 고정 장치에 넣고 머리를 면도하십시오. 절개 전 요오드 용액을 바르고 수술 중 수술 부위를 멸균 상태로 유지하여 감염 위험을 줄입니다. 쥐 뇌 아틀라스에 따르면 Aβ1-40을 정위 정위적으로(4μl) 해마에 정위 정위적으로(4μl) 주입하여 머리바 후 -3.5mm, 정중선 측면 ± 2mm, 경막 아래 -2.8mm에 주입합니다.
- 동물의 편안함을 보장하기 위해 동물이 완전히 의식이 있을 때까지 수술 후 관찰/관리를 제공합니다. 회복하는 동안 동물을 따뜻하게 유지하고 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 케이지에 돌려보내지 마십시오. 수술 후 동물의 감염 징후에 주의하십시오.
- 수술 3주 후 케타민(150mg/kg)으로 동물을 깊숙이 마취합니다. 0.9% 식염수로 동물을 관류한 다음 0.1M 인산염 완충 식염수 또는 PBS(pH = 7.4)에 4% 파라포름알데히드를 관류하여 경심 고정을 수행한 다음 뇌를 제거하고 고정합니다.
- 4°C에서 2-3일 동안 4% 파라포름알데히드에 뇌를 고정합니다.
- 조직 포매 장비를 사용하여 파라핀 블록에 조직을 포획하고 올바른 정렬 또는 절편을 방해할 수 있으므로 카세트를 과소 채우거나 과도하게 채우지 마십시오. 파라핀 블록의 조직 방향에 주의하십시오.
참고: 예를 들어, 쥐 해마는 대뇌 반구의 뒤쪽 부분에 가깝습니다. 따라서 조직은 절편이 뇌의 뒤쪽 부분에서 시작되는 방식으로 매립되어야 합니다. Paxinos 아틀라스를 가이드로 사용하여 원하는 해부학적 구조에 도달하십시오. - 공기 이동으로 인해 섹션 처리가 어려워지므로 미크로톰을 공기 통풍이나 출입구에서 멀리 떨어뜨리십시오.
- 이 깊이는 완전한 성상세포의 Z-Stack 이미지를 생성하는 데 필요하므로 두께가 ≥20μm인 절편을 사용하십시오. 처음 몇 개의 섹션은 열팽창으로 인해 원하지 않는 두께를 가질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
절- 편을 평평하게 만들 수 있을 만큼만 긴 따뜻한 물(5 ± 2°C, 파라핀의 용융 온도보다 낮음) 표면에 절편을 놓습니다.
참고: 단면을 과도하게 팽창하면 구조의 형태를 방해할 수 있습니다. 작은 붓을 사용하여 섹션을 조심스럽게 옮깁니다. 각 슬라이드에서 두세 개의 섹션을 수집합니다. - 슬라이드를 직립 랙에 보관하고 37°C에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다(O/N).
2. 면역조직화학
자
- 일렌에서 절편을 2 x 10분 동안 탈파라핀화하고 알코올 구배(각각 99.8%, 95%, 70%, 10분)와 PBS를 통해 재수화합니다.
- 0.25% 소 혈청 알부민(BSA), 0.25% Triton X-100 및 3.5% 정상 혈청(4°C에서 O/N)을 포함하는 PBS에서 1:1,500으로 희석된 신경교 섬유산성 단백질(GFAP)에 대한 항체와 함께 배양합니다.
- PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
- 2차 알칼리성 인산염 접합 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다(1:100, 21°C, PBS로 희석).
- PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
참고: 배경 염색을 최소화하기 위해 2차 항체 후 절편을 적절하게 세척하는 것이 중요합니다. - 액체 영구 적색 발색원(15-20분)과 함께 어두운 곳에서 절편을 배양합니다.
참고: 사용하기 30분 이내에 용액을 준비하십시오. - PBS에서 3 x 5분 동안 절편을 세척합니다.
- 마지막으로, 커버 슬립 전에 4-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 1:500, PBS로 희석)으로 핵을 염색합니다. 현미경 검사 전에 슬라이드를 냉장고에 24-48시간 동안 보관하십시오.
3. 공초점 현미경 참고
: 정량적 평가(아래 참조)를 위해 오류 위험을 줄이기 위해 최소한의 겹치는 가지가 있는 명확하게 보이는 DAPI 염색 핵이 있는 성상세포를 선택하십시오. Z-Stack 이미지를 생성하는 데는 시간이 많이 걸립니다. 인내심을 갖고 처리 중에 멈추지 마십시오. 직립 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 성상 세포의 3D 이미지를 만드는 데 사용됩니다.
- 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 63X 대물렌즈를 선택합니다.
- 이미징 소프트웨어를 열고 시스템 시작을 클릭합니다. 찾기 탭을 클릭합니다. 할당으로 이동하여 GFP를 선택하여 적절한 조명을 조정합니다.
- 셔터를 열어 빛을 반사합니다. 셔터 오른쪽에서 반사경 리볼버를 찾아 성상세포에 의해 반사되어야 하는 색상(녹색, 빨간색 또는 보라색)을 선택합니다. 여기에는 빨간색(FSet20 wf)이 사용되었습니다.
참고: 현미경의 안구에 직접 사진의 초점을 맞추는 것을 잊지 마십시오. - 최상의 초점을 찾으려면 모두 닫힌 것을 클릭하고 현미경 핀을 화면 모드로 전환한 다음 획득 탭을 클릭합니다.
- Acquisition(획득) 탭에서 Smart Setup(스마트 설정)을 클릭하면 창이 열립니다. 목록에서 적절한 형광단(예: 현재 프로젝트의 DAPI 및 Alexa Fluor 555)을 선택합니다. 색상이 자동으로 선택됩니다.
- Best Signal 및 Apply를 클릭한 다음 Set Exposure를 클릭합니다. 그러면 컴퓨터가 자동으로 노출 매개변수를 설정합니다.
- 이미지를 최적화하려면 채널 창으로 이동합니다. Track2 표시를 해제하고 Track1을 강조 표시한 다음 라이브를 클릭합니다. 필요한 경우 이미지에 초점을 맞춥니다.
- 채널 창에서 다음 키를 조정합니다. 핀홀을 자동으로 최적화하려면 1AU를 클릭합니다. 이 단계를 수행하는 것이 매우 중요하며 그렇지 않으면 공초점 이미지가 최적이 아닙니다. 최상의 강도를 갖도록 게인을 조정합니다(추가 노이즈를 줄이려면 이 설정을 800 미만으로 유지). 마지막으로 디지털 게인을 2에서 3 사이로 설정합니다.
- Track1 표시를 해제하고 Track2를 클릭한 다음 Track2에 대해 3.8단계를 반복합니다. 그런 다음 라이브를 중지하십시오.
- 획득 모드 창으로 이동합니다. 프레임 크기 및 평균화를 최적화하여 이미지를 개선합니다. 프레임 크기를 변경하려면 X*Y로 이동하여 1,024 x 1,024를 선택합니다. 더 나은 이미지를 만들려면 느린 속도를 선택하십시오.
평- 균으로 이동하여 숫자 ≥4를 선택합니다. 이 평균 값은 획득한 이미지를 생성하기 위해 평균화될 스캔 수를 나타냅니다. 이제 스냅 버튼을 클릭하고 캡처한 2D 이미지를 저장합니다.
- 3D 이미징의 경우 스마트 설정 아래에서 Z-Stack 항목을 표시하여 Z-Stack 창이 열립니다.
- Z-Stack의 첫 번째 및 마지막 위치, 즉 셀의 깊이를 설정합니다. 먼저 라이브를 클릭합니다. 그런 다음 현미경의 초점 드라이브를 사용하여 Z-Stack이 시작되는 조직에서 성상세포의 최위 위치에 초점을 맞춥니다. 먼저 설정을 클릭합니다. 그런 다음 Z-Stack 스캔을 중지해야 하는 조직에서 성상세포의 가장 낮은 위치로 초점을 맞춥니다. 마지막으로 설정을 클릭합니다. 그런 다음 라이브를 중지하십시오.
- 간격을 선택합니다. 현재 연구에서는 1.01 μm가 사용되며, 간격을 선택하려면 최적을 클릭하여 슬라이스 수를 설정할 수 있습니다.
- 실험 시작을 클릭합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 이 이미지는 성상세포 영역의 표면적 및 부피뿐만 아니라 가지, 세포체 및 핵을 포함한 전체 성상세포와 같은 매개변수를 측정하는 데 사용됩니다.