동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. LSPC의 준비
- LSPC에 대해 1:1 DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판): 콜레스테롤 비율을 사용합니다. 4 nmole 리포좀 제제의 경우, 플라스크에 2 nmole의 DOTAP과 2 nmole의 콜레스테롤을 10 ml의 1:1 클로로포름:메탄올 용액에 혼합합니다.
- 퓨ム 후드에서 N2 가스를 사용하여 클로로포름:메탄올 용액 9ml를 증발시킵니다. 가스 없이 밤새 흄 후드에서 마지막 1ml의 용매를 증발시킵니다. 플라스크 바닥에 얇은 지질 막이 있는 것을 관찰하십시오.
- 10% 자당 용액 10ml를 55°C로 가열합니다.
- 가열된 10% 자당 용액을 얇은 지질 막에 천천히, 즉 1ml/min 으로 붓면서 플라스크를 부드럽게 소용돌립니다. 지질 분자가 겔-액체 상에 남아 있도록 지질이 포함된 10% 자당과 플라스크를 55°C로 유지합니다. 재수화는 다층 소포(MLV) 형성을 초래합니다.
- 리포좀의 크기를 조정하기 전에 지질이 55°C에서 최소 1시간 동안 재수화되도록 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 1.0μm 필터를 사용하여 압출기를 조립하거나 1.0μm 주사기 필터를 사용하여 크기 조정을 합니다.
- 가열된 리포솜 현탁액 1ml를 압출기의 주사기 중 하나에 넣고 두 주사기 사이에 현탁액을 11회 통과시킵니다. 11회 통과 후 서스펜션이 시작 주사기와 반대쪽 주사기에 있는지 확인하십시오.
- 0.45μm를 통해 리포좀의 크기를 다시 조정한 다음 0.2μm 필터를 통해 큰 단층 소포(LUV)를 생성합니다. 더 쉽게 크기를 조정할 수 있도록 리포솜 현탁액을 가열된 상태로 유지하십시오.
- 20μl의 4nmole 리포솜 현탁액(200μM)을 200μl의 20μM(총 4nmole) 스톡 siRNA 용액과 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 500μM(총 40nmole) 스톡 RVG-9r 용액 80μl를 siRNA/리포좀 용액과 함께 RT에서 10분 동안 배양합니다. LSPC는 가능한 한 빨리 사용해야 하지만 준비 후 최대 몇 시간까지 사용할 수 있습니다. LSPC는 준비 후 몇 시간 동안 4°C에서 보관합니다.
2. 마우스에 LSPC를 주입
- 맥관 구조를 확장하기 위해 마우스를 열 램프에 5-10분 동안 노출시킵니다.
- 주사 5-10분 전과 주사 중에 2-3% 이소플루오란/산소 흐름으로 마우스를 마취합니다. 동물이 더 이상 걸을 수 없고 호흡이 느려지면 발가락을 꼬집어 마취를 확인합니다. 꼬리 정맥에 접근하기 위해 마우스를 등이나 옆으로 눕힙니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
- 꼬리를 70% EtOH로 닦거나 분사하고 26G 인슐린 주사기를 사용하여 300μl의 LSPC를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 꼬리 정맥에 원위부로 주입을 시작하고 정맥이 붕괴되거나 파열되면 근위부로 이동합니다.
- 흉골 누운 자세를 유지할 때까지 마우스를 깨끗한 케이지에 넣으십시오. 마우스가 완전히 회복될 때까지 마우스를 다른 케이지 동료와 함께 두지 마십시오. 쥐는 5-15분 안에 회복되어야 합니다. 회복에 시간이 오래 걸리는 경우 체온을 유지하기 위해 가열 패드나 열 램프 아래에 놓을 수 있습니다. 과열을 방지하기 위해 마우스를 면밀히 모니터링해야 합니다.
- 주사 후 몇 시간 동안 동물을 모니터링하여 마취가 사라지고 치료의 부작용이 없는지 확인하십시오. LSPC가 최소 24시간 동안 순환하도록 합니다.
