신경치료 응용을 위한 유전자 조작 중간엽 줄기 세포의 특성화

Abstract

출처: Sharma, AD, et.al. 신경 보호 전략을 위한 치료 인자 전달을 위해 조작된 성체 줄기 세포의 고처리량 특성화. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 치료용 신경영양 인자를 발현하도록 조작된 형질전환 중간엽 줄기세포를 특성화하는 과정을 보여줍니다. 세포 증식 마커를 표적으로 하는 1차 및 2차 항체로 세포를 고정, 투과화 및 염색한 다음 핵에서 형광 신호를 포착하기 위해 고함량 스크리닝 시스템을 사용하여 분석하는 단계를 간략하게 설명합니다. 증식 마커 발현 증가는 신경 치료 응용에 대한 형질전환 세포의 적합성을 확인합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. Ki67 세포 증식 분석

1. Ki67 세포 증식 분석(면역세포화학)
   세포
   1. 배양물을 0.1M 인산염(PO₄) 완충액으로 1분 동안 두 번 헹굽니다. 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 배양물을 고정합니다. PFA를 제거하고 PBS로 7분 동안 웰을 세 번 헹구십시오.
   2. 최종 헹굼 후, 차단제 용액 100μl(인산염 완충 식염수, 5% 정상 당나귀 혈청, 0.4% 소 알부민 혈청 및 0.2% Triton X-100)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1차 항체인 토끼 항-Ki67을 차단제 용액에 1:200의 작동 비율로 희석하여 준비합니다.
   3. 차단제 용액을 제거하고 100μl의 1차 항체 용액을 각 웰에 도포합니다. 96웰 플레이트를 덮고 샘플을 4°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 다음날 항체 용액을 제거하고 PBS로 7분, 3회 헹굽니다.
   5. 2차 항체인 당나귀 항토끼 Cy3를 1:500의 작동 비율로 차단 용액에 준비합니다. DAPI 핵 염색을 2차 항체 용액에 1:100의 희석으로 첨가합니다. 마지막 PBS 헹굼을 제거한 후, 2차 항체/DAPI 용액 100μl를 각 웰에 도포합니다. 어두운 곳에서 실온에서 90분 동안 배양합니다.
   6. 2차 항체/DAPI 용액을 제거하고 각 웰을 PBS로 7분, 3회 헹굽니다. 96웰 플레이트를 덮고 이미징할 때까지 4°C에서 보관합니다.

2. 자동 이미징 및 다파장 스코어링 분석

1. 96웰 플레이트(이전에 Ki67 면역표지를 위해 처리됨)를 HCS 시스템에 로드하고 플레이트가 20분 동안 평형을 이루도록 합니다. HCS 시스템 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 엽니다.
2. 카메라 비닝을 1로 설정하고 게인 설정을 2로 사용하여 10X 대물렌즈에 대한 획득 설정을 선택합니다. 자동 노출 기능을 활용하여 셀이 상주하는 Z-평면을 찾고 관심 있는 각 파장에 대한 오프셋을 계산합니다. 이 분석을 위해 DAPI(W1), Cy3(W2)에 대한 이미지를 캡처합니다. 네거티브 컨트롤 웰이 이미지 획득을 위한 신호를 표시하지 않는 최대 강도 수준을 선택합니다. 이 설정이 포지티브 웰에 적합한지 확인합니다.
3. 플레이트를 획득합니다. 이미지를 캡처하여 이미지 획득 및 분석 소프트웨어의 데이터베이스에 저장합니다.
4. 이미지를 획득한 후에는 이미지 획득 및 분석 오프라인 소프트웨어를 열고 위에서 획득한 이미지에서 플레이트 데이터를 검토합니다.
5. 다중 파장 점수 분석을 선택합니다. 각 파장에 대한 최소 및 최대 강도를 구성합니다.
   참고: DAPI 검출은 눈에 보이는 각 핵 주변의 염색을 표시해야 합니다. Cy3는 Ki67 면역반응성(IR)으로 양성 세포를 검출해야 하며 음성 대조군에서는 IR을 검출해서는 안 됩니다. Cy3 Ki67 IR의 경우, 대략적인 최소 폭은 7μm, 대략적인 최대 폭은 30μm, 국소 배경 위의 강도는 150 그레이 레벨, 최소 염색 면적은 50μm2였습니다.
6. 모든 위치에 대한 분석을 실행합니다. 스프레드시트에서 볼 데이터를 내보냅니다.

Materials