최소 침습 절제 시스템을 사용한 마우스의 뇌종양 절제

초록

출처: Alomari, S., et al. 생존율이 높은 조직 수집을 위한 설치류에서 최소 침습 뇌종양 절제술의 구현. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 최소 침습 절제 시스템(MIRS)을 사용하여 종양을 이식한 마취된 마우스에서 종양 조직을 절제하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 마우스를 정위 프레임에 고정하고, 뇌에 접근하기 위해 이전 수술 부위를 다시 열고, 흡입과 회전 블레이드를 활용하여 종양 절편을 제거하는 특수 캐뉼라를 삽입하는 작업이 포함됩니다. 절제 후 절제된 조직을 멸균 튜브를 통해 채취하고 상처를 봉합하여 회복할 수 있도록 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 초기 두개내 종양 이식

1. 연구의 초기 단계에서 이전에 발표된 보고서에 따라 4μL의 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 현탁된 100,000개의 세포(GL261 쥐 신경아교종 세포주)를 각 마우스에 두개내로 주입합니다.
2. 종양 이식 후 9일 동안 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 각 마우스의 종양 신호를 정량화합니다.
   참고: 필요한 경우 종양 부하에 따라 마우스를 두 그룹으로 계층화합니다. 본 연구에서 두 그룹은 (1) 종양 부하가 상대적으로 작은 마우스(평균 생물발광 신호 = 5.5e+006 ± 0.1e+006 광자/s, n = 10) 및 (2) 종양 부하가 상대적으로 큰 마우스(평균 생물발광 신호 = 1.69e+007 ± 0.2e+007 광자/s, n = 10), (p < 0.05, Mann-Whitney 테스트).
3. 각 그룹을 두 개의 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다.
   >참고: 이 연구에서 두 하위 그룹은 치료되지 않은 마우스(n = 5)와 MIRS를 사용하여 외과적 절제를 받는 종양이 있는 마우스(n = 5), (p > 0.05, Mann-Whitney 테스트).
4. 절제일부터 종양 성장 패턴에 따른 빈도로 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 종양 진행을 추적합니다.
   참고: GL261 세포주의 경우 절제 당일 종양 진행을 추적한 다음 3-6일마다 추적합니다.

2. MIRS를 이용한 종양 절제

유도

1. 챔버에서 이소플루란-_O2 가스 혼합물을 사용하여 마우스를 마취하거나 자일라진/케타민 용액을 복강내 주사합니다.
   1. 가스 마취제를 사용하는 경우 마취 유도를 위해 가스 유량을 1.0mL/min으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다( 재료 표 참조).
   2. 주사 가능한 마취제를 사용하는 경우, 0.2mL의 마취액(80-100 mg/kg의 케타민 및 10-12.5 mg/kg의 자일라진, 재료 표 참조)을 복강 내 주입하여 마우스를 마취시킵니다.
2. 발가락을 꼬집어 동물의 적절한 진정 상태를 평가하십시오. 각막의 건조를 방지하기 위해 눈에 안용 연고를 바르십시오. 시술 전에 진통제(0.03-0.06 mg/kg 부프레노르핀 피하 투여)를 투여하십시오.
3. 완전한 진정이 확인되면 마우스를 정위 프레임( 재료 표 참조)에 놓습니다.
   참고: 가스 마취제를 사용하는 경우 마우스의 코를 노즈 콘에 놓고 시술 중에 이소플루란-_O2 혼합물을 계속 받습니다(1.5%).
4. 이전 스테이플을 제거한 다음 제모 크림이나 면도로 머리카락을 제거합니다. 클로르헥시딘/베타딘 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독합니다. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다.
안정성
5. 과 정밀도를 높이기 위해 tage 어댑터/핸드피스 홀더를 통해 MIRS 핸드피스를 정위 암에 부착합니다.
6. 다음 설정을 사용하여 MIRS 기계를 설정합니다( 재료 표 참조).
   1. 후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 토글(1 = ON, 0 = OFF)하여 시스템 전원을 켜거나 끕니다.
   2. 질소 호스(콘솔과 함께 제공됨)의 한쪽 끝을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다. 연결 너트를 시계 방향으로 돌려 연결을 조입니다.
      알림: 호스의 반대쪽 끝을 질소 공급 장치에 연결해야 합니다.
   3. 호스를 질소 공급 장치에 부착하기 전에 공급 압력이 콘솔에 권장되는 입력 공급 압력인 100psig를 초과하지 않는지 확인하십시오.
      알림: 질소가 콘솔에 공급되면 풋 페달로 활성화되면 콘솔이 자체 흡인을 생성합니다.
   4. 진공 포트의 뚜껑을 고정하고 밀봉하여 진공 시스템의 누출을 방지하십시오. 흡인 시스템의 누출은 MIRS 콘솔의 성능에 영향을 미칩니다.
   5. 설정 또는 프라이밍 중에 흡인이 17 미만인 경우 콘솔 전면의 흡인 손잡이가 최대 레벨(100)으로 설정되어 있는지 확인하고 흡인 시스템에 누출이 없는지 확인하고 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오.
   6. 풋 페달을 콘솔에 연결하려면 딸깍 소리가 나서 제자리에 맞을 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다.
      참고: 풋 페달 커넥터는 콘솔에 한 방향으로 연결되며 키가 있습니다.
   7. 핸드피스를 콘솔에 연결하려면 딸깍 소리가 나서 제자리에 맞을 때까지 파란색 핸드피스 커넥터를 파란색 콘센트에 삽입합니다.
      알림: 핸드피스 커넥터는 콘솔에 한 방향으로 연결되며 키가 있습니다.
   8. 시스템을 사용하기 전에 작은 그릇에서 멸균 유체를 구멍으로 흡입하고 튜브와 핸드피스를 통해 캐니스터로 흡입하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되어 조직 폐색을 줄이도록 하여 각 핸드피스를 프라이밍합니다.
   9. 콘솔의 전면 패널에서 적절한 모드를 선택하여 단독으로 흡인 또는 절단을 통한 흡인을 준비하십시오. 풋 페달을 사용하여 시작합니다.
7. 23G MIRS 캐뉼라를 버 구멍에 2.5mm 깊이까지 삽입합니다.
8. 캐뉼라에 연결된 풋 페달을 밟아 절제 과정을 시작합니다. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 한 전체 주기(360°) 이상의 절제를 수행합니다.
   참고: 더 많은 주기를 수행할수록 더 많은 양의 종양 조직을 절제합니다.
9. 절제 과정이 완료되면 버 구멍에서 23G MIRS 캐뉼라를 빼내고 5mL의 1x PBS를 사용하여 튜브를 세척하고 잔여 파편을 제거합니다.
10. 정위 프레임에서 마우스를 제거하고 스테이플러 또는 4-0 봉합 재료로 상처를 봉합합니다( 재료 표 참조).
11. 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 마취에서 회복하는 동안 가열 패드나 따뜻한 조명 아래에 마우스를 놓습니다.
12. 실험이 완료되면 플러싱을 통해 캐뉼라를 퍼지합니다. 냉각된 배지와 공기를 번갈아 가며 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 "밀어냅니다". 시스템에서 수집 용기를 제거하고 제공된 캡으로 뚜껑을 닫습니다.
13. 2.12단계를 완료한 후 캐뉼라의 원위 끝을 3% H₂O₂에 넣고 24-25 in Hg에서 흡입을 가하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터로 다시 채우고 60-90초 동안 그대로 둡니다.
14. 시술 후 신경학적 징후(비정상적인 불규칙한 움직임 또는 발작)가 있는지 마우스를 모니터링합니다.

결과

그림 1: MIRS 시스템 설정. (A) 조직이 통합된 설치류 모델의 뇌종양에 대한 최소 침습 절제 시스템(MIRS) 보존 시스템. (B) MIRS 콘솔의 전면 패널. 1 = 시스템 전원, 2 = 풋 페달, 3 = 프라임 버튼, 4 = 흡인, 5 = 흡인 레벨 제어 다이얼, 6 = 흡인 레벨 표시기, 7 = 핸드피스, 8 = 커터 활성화 버튼. (C

재료