쥐의 열 통증 반응에 대한 진통제의 두개내 및 복강내 전달의 시너지 효과

초록

출처: Martinez, E., et al. 설치류의 두개내 약물 요법 및 통증 분석. J. Vis. 경험. (2019).

이 비디오는 전두엽 피질에 사전 이식된 가이드 캐뉼라를 사용하여 마취된 쥐에서 진통제를 두개내 투여하는 방법을 보여줍니다. 추가 진통제를 복강 내 병용 투여합니다. 회복 후, 쥐의 열 통증 반응은 투여된 약물의 진통 효과를 평가하기 위해 발 철수 잠복기를 측정하는 Hargreave 장치를 사용하여 평가됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 정위 캐뉼라 이식

1. 10-12주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다.
2. 1.5-2% 이소플루란으로 동물을 마취시킵니다. 동물이 날카로운 집게로 강한 꼬집음에 반응하지 않으면 수술을 수행하십시오. 손상을 방지하기 위해 모든 기구를 오토클레이브하고, 멸균 수술용 장갑을 사용하고, 동물의 눈에 안용 연고를 추가하십시오.
3. 좌표 전후방(AP): +2.9mm, 내외측(ML): +/-1.6mm, 배복부(DV): -2.1mm. 캐뉼라를 삽입하려면 사용된 캐뉼라의 크기에 따라 구멍 직경을 사용하여 원하는 좌표에서 두개골에 구멍을 뚫습니다.
   참고: 여기에서 PFC는 이전 여러 연구에서 입증된 통증 처리에서 중요한 역할 때문에 두개내 임플란트의 잠재적 표적으로 연구되었습니다. 다른 특정 뇌 영역의 기능을 연구하기 위해 연구자들은 뇌 지도책에 따라 다른 좌표를 사용할 수 있습니다.
4. 쥐가 최소 1주일 동안 수술에서 회복되도록 하십시오. 수술 후 회복 전에 피하액을 주입하여 대사 요구 사항을 지원하고 새로 닫힌 절개 부위에 국소 부피바카인을 도포합니다. 동물이 깨어날 때까지 따뜻한 패드 위에 올려 놓고 수술 후 3일 동안 동물을 모니터링하여 건강과 적절한 회복을 보장합니다.
5. 동물이 수술에서 완전히 회복되면 주사를 시작합니다(다음 단계).

2. 두개내 및 복강내 주사 두

1. 개내 주사의 경우 이식된 가이드를 넘어 1.0mm 확장되는 33게이지 인젝터 캐뉼라가 있는 10μL 해밀턴 주사기의 한쪽 끝에 부착된 PE-50 튜브를 사용합니다.
2. 이들 쥐의 PFC에 연구 약물 또는 식염수 중 0.5μL(또는 원하는 경우 그 이하)를 주입합니다. PFC는 쥐에서 더 큰 영역이기 때문에 이 양은 다른 영역으로 퍼지지 않습니다. 그러나 더 작은 뇌 영역이나 생쥐의 경우 더 작은 부피를 사용하십시오. 주입량은 뇌 부위와 동물의 종에 따라 다릅니다.
   참고: DMSO는 신경독성이 있으므로 식염수는 디메틸설폭사이드(DMSO) 대신 대조군으로 사용해야 합니다. 그러나 연구에 따르면 50% 미만의 DMSO(즉, 이 경우와 같이 총 부피 0.3μL 미만)는 행동 연구를 방해하지 않을 수 있으므로 매우 적은 양의 DMSO는 주입에 안전할 수 있습니다.
3. 100초 동안 양측으로 부피를 주입하고 제거하기 전에 추가로 60초 동안 인젝터 캐뉼라를 제자리에 유지하여 이 용액이 천천히 확산될 수 있도록 합니다.
4. 시너지 약리학적 효과에 대한 연구를 위해 전신 방법을 통해 다른 약물을 병용 투여하십시오. 이 경우 원하는 약물을 주입하거나 두개내로 조절한 후 즉시 복강 내 추가 약물을 투여합니다. 예를 들어, 본 연구에서는 부가적 효과를 테스트하기 위해 모르핀과 암파킨의 시너지 진통 효과를 연구했습니다. 우리는 1mg/kg 모르핀(안전한 전신 용량)의 복강 내 전달과 함께 AMPAkine을 두개내로 주입했습니다.
   참고: 복강내 주사보다 수행하기가 더 어렵기 때문에 두개내 주사를 먼저 하는 것이 좋습니다.

3. 진통 분석 및 평가

1. 쥐의 급성 통증 행동에 대한 두개내 주사의 효과를 연구하려면 발바닥 검사(Hargreaves' test)를 사용하여 열 자극에 대한 인단 잠복기를 계산합니다. Hargreaves의 장치는 유리 평면을 통해 적외선 빔을 쥐의 발에 집중시킵니다. 쥐는 유리면 위에 서서 자유롭게 움직이고 있습니다. Hargreaves의 테스트를 수행할 때 쥐 발의 발바닥 영역 아래에 적외선 빔의 초점을 맞춥니다.
   1. 비교를 위한 기준선 값을 설정하기 위해 주사 전에 기준선 Hargreaves's 테스트를 수행하는 것으로 시작합니다.
2. 기준선을 설정하기 전에 어떤 종류의 약물도 주사하지 마십시오. 5분 간격으로 다섯 번의 좋은 시험을 실시한다. 좋은 시도는 명확한 금단, 즉 쥐가 무릎을 구부리고 발을 위쪽으로 들어 올려 몸 안으로 들어올릴 때 나타납니다.
   참고: 쥐의 감작을 방지하기 위해 시도가 5분 간격으로 이루어지도록 하십시오. Hargreaves의 장치는 적외선 빔이 파괴되면 철수 시간을 자동으로 기록합니다. 결과적으로 이동, 체중 이동 등으로 인한 시도를 할인해야 합니다. 할인된 평가판이 발생하면 5분 동안 기다렸다가 평가판을 반복합니다.
3. 5번의 시도의 평균을 취하여 철회 임계값을 계산합니다.
4. 기준선 평균을 얻은 후 약물 주입 후 금단 시간을 얻기 위해 실험을 시작합니다. Hargreaves의 검사는 두개내 주사 후 20-30분 후에 수행할 수 있지만 정확한 시기는 특정 제제의 약동학에 따라 달라질 수 있습니다. 이는 쥐가 약물을 흡수하고 그 효과를 경험하고 있는지 확인하기 위한 것입니다. 이 실험은 3.1단계와 동일한 방식으로 수행합니다.
5. 3.2단계에서 언급한 대로 출금 임계값을 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스테로유틱 캐뉼라	플라스틱One	8I26GA8MMKIT
디지털 주사기	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethyl Sulfoxide	시그마 알드리치	D4540
Hargreaves 장치	Ugo Basile	37370
수컷 Sprague-Dawley 쥐	Taconic Farms	NTac:SD
멸균 수술용 장갑	Dynarex	6535