$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 동물의 수술 준비
- 깨끗하고 전용 공간에서 수술을 진행하세요. 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 수술 전에 유리 구슬 멸균기로 멸균합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 출생 후 10-12일(P10-12) FVB 마우스를 사용합니다. 특정 프로젝트의 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 연령과 계통의 마우스를 사용할 수 있습니다. P40보다 나이가 많은 쥐는 수포 뼈가 더 단단해지기 때문에 어려울 수 있습니다. - 케타민 염산염(100mg/kg), 자일라진 염산염(10mg/kg) 및 아세프로마진(2mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 동물이 발가락 꼬집기와 같은 고통스러운 자극에 더 이상 반응하지 않는 후에만 수술 준비를 시작하십시오. 필요한 경우 마취 칵테일의 추가 용량(원래 용량의 5분의 1)을 투여하여 원래 마취 평면을 복원합니다.
참고: 이 연령에 관찰되는 대부분의 사망률은 마취 과다 복용으로 인해 발생하므로 이 단계에서 주의하십시오. 마- 취 중에 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보호용 안과 연고로 동물의 눈을 덮고 동물의 깜박임 반사를 억제합니다.
- 마취 후 저체온증을 예방하려면 마우스가 완전히 깨어날 때까지 시술 내내 목을 펴고 가열 패드 위에 마우스를 배치합니다.
- 외과적 조작 전에 이발기로 왼쪽 귀 후 부위를 면도하고 70% 에탄올과 포비돈-요오드로 소독합니다.
2. 수술 절차 및 벡터 주입
- 고막 수포를 노출시키기 위해 귀 후 접근법을 사용합니다. 작은 가위로 피하 조직을 절개하여 귓바퀴 후 근육을 노출시킵니다. 지방 조직을 절개 부위 뒤쪽으로 후퇴시킨 후 절개 부위에 수직으로 좌우 근육을 분리하여 측두골을 노출시킵니다. 이 절개 부위가 적절한 시각화로 편안하게 작동할 수 있을 만큼 충분히 길지 확인하십시오.
- 25G 바늘로 고막 수포를 천공하고 필요에 따라 집게로 구멍을 확장하여 뼈를 다시 벗겨 달팽이관의 기저 회전에 접근할 수 있도록 한 다음 골개 동맥과 둥근 창막(RWM)을 시각화할 수 있도록 충분히 넓힙니다.
- 붕규산 모세관 피펫으로 RWM의 중앙을 부드럽게 뚫습니다. 이 시점에서 RWM을 통한 유체 유출을 관찰하십시오. 이것은 정상입니다. 유출물이 안정화될 때까지 기다리십시오(달팽이관에서 유출된 유체는 멸균 여과지로 건조됨).
알림: 유리바늘을 잡고 전진할 때 RWM 천공이 가능한 한 작아지도록 주의하십시오. 사용하는 현미경에 따라 마이크로 매니퓰레이터를 사용하거나 피펫 홀더를 사용하여 손으로 피펫을 잡습니다. - 패치 클램프 피펫을 준비하는 것과 같은 방식으로 피펫 풀러를 사용하여 주입할 피펫을 준비합니다. 팁 직경이 크고(직경 약 15μm) 바이러스를 쉽게 안팎으로 피펫팅
할 수 있도록 하십시오.- 1-2μl의 아데노 관련 바이러스(AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 또는 AAV2-GFP)를 주입 피펫에 추출합니다. 유출이 안정화된 후(5-10분), 이전에 RWM에서 만든 것과 동일한 구멍을 통해 이 고정 부피를 고막 스칼라에 미세 주입합니다.