인간 유래 중간 뉴런 전구 세포를 마우스 새끼 해마에 이식

초록

출처: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마로 이식. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 흥분-억제 균형을 회복하는 것을 목표로 억제성 중간 뉴런이 감소된 유전자 변형 쥐 새끼의 해마에 인간 유래 중간 뉴런 전구체 세포를 정위 주입하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 해마 내 세포 이식

참고: 이 섹션의 모든 단계는 동물 시설의 세포 배양 후드 외부에서 수행됩니다. 출생 후 뇌로의 초기 세포 이식은 출생 당일 P0을 고려하여 P2에서 수행되었습니다.

1. 아래 단계에 따라 이식 실험을 준비하십시오.
   1. 모든 수술 재료를 오토클레이브하거나 가능하지 않은 경우 승인된 다른 방법으로 멸균하십시오.
   2. 유리 모세관 없이 주입 주사기를 홀더에 장착합니다. 바늘을 물로 헹굽니다.
      참고: 바늘은 33G이어야 합니다.
   3. 30G 인슐린 바늘 끝을 90° 구부립니다.
   4. 머리를 평평하게 하여 강아지를 배치하기 위해 수제 Play-Doh와 같은 무대를 만듭니다(그림 1A).
   5. 새로운 환경에 적응할 수 있도록 수술을 위해 준비하기 전에 어미와 새끼와 함께 쥐 케이지를 가져오십시오.
   6. 젖은 얼음이 담긴 트레이와 이소플루란용 종이가 있는 빈 케이지를 준비합니다.
2. 쥐 강아지를 마취합니다.
   종
   1. 이를 이소플루란에 적셔( 재료 표 참조) 빈 케이지 안에 넣습니다. 강아지 한 마리를 조심스럽게 가져다가 이소플루란에 적신 종이와 함께 새장에 넣습니다.
      참고: 어미에게 세 마리 미만의 강아지를 두지 마십시오. 이소플루란 마취 20-30초를 초과하지 않으면 강아지가 죽을 수 있습니다.
   2. 움직임 중단으로 마취의 효과를 확인합니다.
   3. 마취 직후 젖은 얼음 표면의 젖은 티슈 위에 강아지를 놓습니다. 상지가 하얗게 변할 때까지 동물을 얼음 위에 3분 동안 두십시오(그림 1B, 파란색 화살표). 일반적으로 2-3분이 소요됩니다.
   4. 이 시간을 사용하여 주사기에 세포 현탁액을 넣으십시오. 이전에 피펫으로 세포를 조심스럽게 재현탁하십시오.
   5. 강아지를 정위 고정 프레임에 놓습니다. 이어바를 반대 방향으로 사용하십시오(그림 1A, 자홍색 화살표).
      알림: 이어바의 뒷면은 덜 뾰족하고 P2 강아지에게는 귀가 없으므로 동물을 다치게 하지 않도록 더 평평한 면을 사용하십시오.
   6. 옆에서 머리가 곧게 펴져 있는지 확인하십시오. 머리는 평평해야 합니다. Play-Doh와 같은 단계를 사용하여 이를 조정하십시오.
      참고: 이 나이의 강아지는 아직 눈을 뜨지 않았으므로 이와 관련하여 추가 조치를 취할 필요가 없습니다. 이 나이의 강아지는 털이 없으므로 해당 부위를 면도할 필요가 없습니다. 피부를 개방하는 절개가 아니며 봉합이 필요하지 않기 때문에 특별한 통증 치료는 제공되지 않습니다.
   7. 수술 기간 내내 강아지를 얼음 위(티슈 페이퍼 위)에 덮어 두십시오.
      참고: 강아지의 피부에 직접 닿는 곳에 얼음을 두지 마십시오.
3. 주입을 수행합니다.
   1. 에탄올에 적신 연조직을 사용하여 피부 표면을 청소합니다.
   2. 람다를 식별하고 정위 기기의 디지털 디스플레이 콘솔에서 좌표를 0으로 설정합니다(그림 1C, 노란색 점선). 시상 봉합사와 람도이드 봉합사는 빨간색 선으로 혈관화되어 있기 때문에 눈에 쉽게 보입니다.
      참고: 람다를 시각화하는 데 어려움이 있는 경우 피부에 작은 얼음 조각을 놓고 식을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 그런 다음 얼음 조각을 제거하면 피부가 미묘하게 미백되어 시각화할 수 있습니다.
   3. 주사 바늘을 원하는 좌표로 재배치합니다. 설명된 프로토콜에서 표적 영역은 해마였으며 좌표는 다음과 같습니다: 전방-후방(AP) +0.85 및 중앙-외측(ML) +1.35.
   4. 90° 구부러진 인슐린 바늘을 사용하여 두개골을 관통하고 작은 구멍을 만듭니다.
   5. 주사 바늘이 두개골을 가로지르게 될 때까지 주사 바늘을 내리고 배-복부(DV) 좌표를 0으로 만듭니다. 원하는 DV 좌표가 될 때까지 바늘을 내립니다. 설명된 프로토콜에서 좌표는 DV -1.1이었습니다.
   6. 미리 정해진 시간 간격에 따라 주입합니다.
      참고: 설명된 프로토콜에서 정확한 타이밍은 다음과 같습니다: (i) DV 좌표로 내려간 후 3분 동안 기다리고, (ii) 5분 동안 1μL의 부피를 주입하고, (iii) 모든 부피가 주입된 후 3분 동안 기다립니다.
   7. 바늘을 천천히 집어넣습니다.
4. 절차를 종료합니다.
   참고: 강아지의 생존을 보장하고 저체온증에 의한 마취로 인한 손상을 방지하기 위해 수술은 15분 이상 지속될 수 없습니다.
   1. 강아지가 움직이기 시작할 때까지 손으로 강아지를 따뜻하게 한 다음 어미에게 돌려주세요.
   생
   2. 체 내에서 세포 분화를 계속하기 위해 이식(PT) 전 최소 2일 및 이식 후 3주 동안 0.5% 자당 용액에 1mg/mL 농도의 DOX를 식수로 투여합니다.

결과

그림 1: P2에서 갓 태어난 쥐 새끼의 S tereotacic 이식. (ᅡ) Play-Doh와 같은 스테이지는 강아지의 몸을 제자리에 고정하고 거꾸로 된 이어바(자홍색 화살표)를 사용하는 데 사용됩니다. (B) 흰색 앞발(파란색 화살표)은 해당 부위의 혈류 감소를 나타내므로 강아지는 저체온증을 통해 마취를 경험하고 있습니다. (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30 G 바늘	B Braun	4656300
해밀턴 주사기용 33G 바늘	해밀턴	7762-06
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J	Jackson Laboratory	17482	동물 모델
C57BL/6J	Janvier Labs		동물 모델
디지털 스테레오택스	KOPF	모델 940
독시사이클린	시그마-알드리치	D9891	2 μg/mL
에탄올	솔베코		70%, 95%, 99.8%
H1(WA01) ESC	WiCell	WA01	MTA 계약에 따른 인간 배아 줄기 세포주
해밀턴 주사기	Hamilton	7634-01	5 μL
이소플루란 박스터	Apoteket AB
마우스 어댑터 스테레오택스	RWD	68030
푸로마이신(이염산염)	Gibco	A1113803
핀셋	VWR