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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 해마 내 세포 이식
참고: 이 섹션의 모든 단계는 동물 시설의 세포 배양 후드 외부에서 수행됩니다. 출생 후 뇌로의 초기 세포 이식은 출생 당일 P0을 고려하여 P2에서 수행되었습니다.
- 아래 단계에 따라 이식 실험을 준비하십시오.
- 모든 수술 재료를 오토클레이브하거나 가능하지 않은 경우 승인된 다른 방법으로 멸균하십시오.
- 유리 모세관 없이 주입 주사기를 홀더에 장착합니다. 바늘을 물로 헹굽니다.
참고: 바늘은 33G이어야 합니다. - 30G 인슐린 바늘 끝을 90° 구부립니다.
- 머리를 평평하게 하여 강아지를 배치하기 위해 수제 Play-Doh와 같은 무대를 만듭니다(그림 1A).
- 새로운 환경에 적응할 수 있도록 수술을 위해 준비하기 전에 어미와 새끼와 함께 쥐 케이지를 가져오십시오.
- 젖은 얼음이 담긴 트레이와 이소플루란용 종이가 있는 빈 케이지를 준비합니다.
- 쥐 강아지를 마취합니다.
종- 이를 이소플루란에 적셔( 재료 표 참조) 빈 케이지 안에 넣습니다. 강아지 한 마리를 조심스럽게 가져다가 이소플루란에 적신 종이와 함께 새장에 넣습니다.
참고: 어미에게 세 마리 미만의 강아지를 두지 마십시오. 이소플루란 마취 20-30초를 초과하지 않으면 강아지가 죽을 수 있습니다. - 움직임 중단으로 마취의 효과를 확인합니다.
- 마취 직후 젖은 얼음 표면의 젖은 티슈 위에 강아지를 놓습니다. 상지가 하얗게 변할 때까지 동물을 얼음 위에 3분 동안 두십시오(그림 1B, 파란색 화살표). 일반적으로 2-3분이 소요됩니다.
- 이 시간을 사용하여 주사기에 세포 현탁액을 넣으십시오. 이전에 피펫으로 세포를 조심스럽게 재현탁하십시오.
- 강아지를 정위 고정 프레임에 놓습니다. 이어바를 반대 방향으로 사용하십시오(그림 1A, 자홍색 화살표).
알림: 이어바의 뒷면은 덜 뾰족하고 P2 강아지에게는 귀가 없으므로 동물을 다치게 하지 않도록 더 평평한 면을 사용하십시오. - 옆에서 머리가 곧게 펴져 있는지 확인하십시오. 머리는 평평해야 합니다. Play-Doh와 같은 단계를 사용하여 이를 조정하십시오.
참고: 이 나이의 강아지는 아직 눈을 뜨지 않았으므로 이와 관련하여 추가 조치를 취할 필요가 없습니다. 이 나이의 강아지는 털이 없으므로 해당 부위를 면도할 필요가 없습니다. 피부를 개방하는 절개가 아니며 봉합이 필요하지 않기 때문에 특별한 통증 치료는 제공되지 않습니다. - 수술 기간 내내 강아지를 얼음 위(티슈 페이퍼 위)에 덮어 두십시오.
참고: 강아지의 피부에 직접 닿는 곳에 얼음을 두지 마십시오.
- 주입을 수행합니다.
- 에탄올에 적신 연조직을 사용하여 피부 표면을 청소합니다.
- 람다를 식별하고 정위 기기의 디지털 디스플레이 콘솔에서 좌표를 0으로 설정합니다(그림 1C, 노란색 점선). 시상 봉합사와 람도이드 봉합사는 빨간색 선으로 혈관화되어 있기 때문에 눈에 쉽게 보입니다.
참고: 람다를 시각화하는 데 어려움이 있는 경우 피부에 작은 얼음 조각을 놓고 식을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 그런 다음 얼음 조각을 제거하면 피부가 미묘하게 미백되어 시각화할 수 있습니다. - 주사 바늘을 원하는 좌표로 재배치합니다. 설명된 프로토콜에서 표적 영역은 해마였으며 좌표는 다음과 같습니다: 전방-후방(AP) +0.85 및 중앙-외측(ML) +1.35.
- 90° 구부러진 인슐린 바늘을 사용하여 두개골을 관통하고 작은 구멍을 만듭니다.
- 주사 바늘이 두개골을 가로지르게 될 때까지 주사 바늘을 내리고 배-복부(DV) 좌표를 0으로 만듭니다. 원하는 DV 좌표가 될 때까지 바늘을 내립니다. 설명된 프로토콜에서 좌표는 DV -1.1이었습니다.
- 미리 정해진 시간 간격에 따라 주입합니다.
참고: 설명된 프로토콜에서 정확한 타이밍은 다음과 같습니다: (i) DV 좌표로 내려간 후 3분 동안 기다리고, (ii) 5분 동안 1μL의 부피를 주입하고, (iii) 모든 부피가 주입된 후 3분 동안 기다립니다. - 바늘을 천천히 집어넣습니다.
- 절차를 종료합니다.
참고: 강아지의 생존을 보장하고 저체온증에 의한 마취로 인한 손상을 방지하기 위해 수술은 15분 이상 지속될 수 없습니다. - 강아지가 움직이기 시작할 때까지 손으로 강아지를 따뜻하게 한 다음 어미에게 돌려주세요.
생- 체 내에서 세포 분화를 계속하기 위해 이식(PT) 전 최소 2일 및 이식 후 3주 동안 0.5% 자당 용액에 1mg/mL 농도의 DOX를 식수로 투여합니다.
