마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

초록

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 초점 DNA 주입<ol style='list-style-type:decimal;'>각
2. 벡터에 대해 1μg/μL의 농도로 발현 벡터의 데옥시리보핵산(DNA) 혼합물을 준비합니다: pCAGGs-IRES-GFP(대조군 벡터) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP. 빠른 녹색 용액(스톡 25 mg/mL)을 1/10 희석액으로 첨가합니다.
3. 당긴 유리 마이크로피펫(내경 0.5mm 및 외경 1mm)에 10μL의 DNA 혼합물을 채우고 슬라이스의 선택된 영역(내측 신경절 융기 또는 MGE/꼬리 신경절 또는 CGE)에 소량(25-50nL 범위)을 주입합니다(그림 1 및 그림 2).

급성 전기천공법
참고: 전기천공술은 국소 DNA 주입 직후에 수행해야 합니다.

작은
1. 아가로스 블록을 페트리 접시 전극에 놓고 끝이 평평한 마이크로 주걱을 사용하여 아가로스 컬럼을 모바일 커버 전극에 부착합니다.
2. 지지 멤브레인이 있는 슬라이스를 아가로스 블록으로 옮기고 아가로스 컬럼이 있는 상단 전극을 슬라이스의 선택된 영역(MGE/CGE) 위에 놓습니다.
   참고: 125V의 충전 전압(각각 5ms의 펄스 2개, 간격 500ms)은 성공적인 전기천공을 생성합니다(그림 3).

전기천공 후, 지지 막이 있는 슬라이스를 접시에 놓고 37°C의 CO₂ 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다.

결과

그림 1: 급성 전기천공 실험에 사용되는 대표적인 종뇌 절편. (A-C) Telencephalic 절편은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)으로 염색된 3개의 뚜렷한 순차적 주위 꼬리 수준에서 얻어졌습니다. LGE: 외측 신경절 융기; MGE: 내측 신경절 융기; CGE: 꼬리 신경절 융기. 스케일 바 = 200μm. 노란색 별표는 각 슬라이스의 전기천공 부위를 나타냅니다. 흰색 선은 신경절 융기의 가장자리를 표시합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Medium/Supplements
Neurobasal medium	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21103-049	뉴런 기본 배지
장비
전기천공기	BTX	ECM 830 발생기
급성 슬라이스 전기천공용 인젝터	Eppendorf	FemtoJet 마이크로인젝터
연 수동 미세 조작기	WPI	KITE-M3-R
플래티넘 전자 (I)	Protech International Inc.	CUY-700-1
플래티넘 일렉크로드 (II)	프로텍 인터내셔널 Inc.	CUY-700-2
강철 베이스 플레이트	WPI	5479
기타 재료
전기 천공 용 유리 모세관	VWR	1B100-4
장기 조직 배양 접시	BD Biosciences (Falcon)	353037