마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

1. 초점 DNA 주입<ol style='list-style-type:decimal;'>각
2. 벡터에 대해 1μg/μL의 농도로 발현 벡터의 데옥시리보핵산(DNA) 혼합물을 준비합니다: pCAGGs-IRES-GFP(대조군 벡터) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP. 빠른 녹색 용액(스톡 25 mg/mL)을 1/10 희석액으로 첨가합니다.
3. 당긴 유리 마이크로피펫(내경 0.5mm 및 외경 1mm)에 10μL의 DNA 혼합물을 채우고 슬라이스의 선택된 영역(내측 신경절 융기 또는 MGE/꼬리 신경절 또는 CGE)에 소량(25-50nL 범위)을 주입합니다(그림 1 및 그림 2).

그림 1: 급성 전기천공 실험에 사용되는 대표적인 종뇌 절편. (A-C) Telencephalic 절편은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)으로 염색된 3개의 뚜렷한 순차적 주위 꼬리 수준에서 얻어졌습니다. LGE: 외측 신경절 융기; MGE: 내측 신경절 융기; CGE: 꼬리 신경절 융기. 스케일 바 = 200μm. 노란색 별표는 각 슬라이스의 전기천공 부위를 나타냅니다. 흰색 선은 신경절 융기의 가장자리를 표시합니다.

그림 2: 실험 워크플로의 개략도. (A) 마우스 뇌 절편을 적절한 구조물로 전기천공하고, (B) 12시간 후, 변형된 피질 중간 뉴런(CI) 전구체를 분리하고 (C) 갓 태어난 쥐 새끼의 팔륨에 이식합니다(P0-P2). 미성숙 CI의 활성을 수정하기 위해, 세포 이식을 받은 P14 새끼에게 제시된 프로토콜에 따라 4일 동안 CNO 또는 비히클을 주입하였다. (ᅡ') 급성 마우스 뇌 절편 전기천공 설정 사진.

3: 대표적인 성공적인 급성 슬라이스 전기천공 실험. (A) pCAGGs-IRES-GFP(녹색 형광 단백질) 및 pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP(적색 형광 단백질) 플라스미드를 모두 CGE에 형질감염하고 12시간 동안 배양한 E14.5 배아 뇌의 대표적인 관상 절편. 이 절편은 GFP(A, B, C) 및 RFP(A, B, D)에 대해 면역염색되었습니다. 패널 A의 박스형 영역은 형광 리포터(B), GFP(C) 및 RFP만(D)의 발현을 모두 표시하기 위해 확대됩니다. 흰색 선은 신경절 융기의 가장자리를 표시합니다. B-D: 동일한 사진, 다른 채널 또는 서로 다른 두 채널의 조합. 스케일 바 = 200 μm (A), 100 μm (BD).