이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.
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방법 논문
척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입
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2025년 8월 7일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. AAV-miRNA 플라스미드의 꼬리 정맥 주사
참고: 이 단계는 표적 유전자와 마우스의 나이 및 체중에 따라 조정이 필요합니다. IACUC(Institutional and Animal Care and Use Committee) 지침을 사용하여 마우스의 나이와 체중에 따라 용량 범위, 부피 및 최적의 투여 경로를 결정합니다. 표적 조직의 GFP(녹색 형광 단백질) 형광 신호 및 miRNA 발현 수준은 주사 후 2주부터 최고조에 달할 것으로 예상됩니다. 다음 프로토콜은 초기 성인기의 수컷 마우스를 나타냅니다. AAV는 생물안전 레벨 1 지침에 따라 생물학적 위험으로 취급되어야 합니다.
- 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 mL당 1010-10 11 바이러스 게놈(vg/mL)의 바이러스 부하를 포함하는 100-200μL 분취량으로 AAV-miRNA 플라스미드 스톡을 나눕니다. AAV 용액을 취급하려면 실험실 생물학적 위험 개인 보호 장비를 사용해야 합니다.
참고: 분취량이 해동되면 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 바이러스 스톡은 -80°C 냉동고에 보관할 수 있습니다. - 적절한 크기의 플라스틱 또는 테이퍼형 플라스틱 필름 튜브와 같은 시중에서 판매되는 구속 장치에 마우스를 구속하십시오.
- 70% 알코올 물티슈로 꼬리 표면을 청소하십시오.
- 꼬리 아래에 따뜻한 패드(28-30°C)를 30초 동안 대고 혈관 확장을 증가시킵니다. 또는 빨간색 열 램프(2-3피트 거리)를 사용하거나 꼬리를 따뜻한 물에 담가 동물을 따뜻하게 합니다.
- 꼬리의 말단 부분에서 시작하여 바이러스 분취량이 적힌 바늘(27-30G)을 꼬리에서 15° 비스듬하게 정맥에 삽입합니다. 주입하기 전에 바늘이 올바르게 삽입되었는지 확인하십시오.
- 주사 중 저항이 느껴지거나 피부 아래에 붓기가 나타나면 시술을 중단하십시오. 바늘을 제거하고 이전 주사 부위 위에 다시 삽입합니다.
참고: 또는 바늘을 부드럽게 흡인하고 혈액을 관찰하여 이를 달성할 수 있습니다. 강한 흡인은 꼬리 정맥을 무너뜨릴 수 있습니다. 주사 중 정맥이 희게 되면 바늘이 올바르게 삽입된 것입니다.
- 주사 중 저항이 느껴지거나 피부 아래에 붓기가 나타나면 시술을 중단하십시오. 바늘을 제거하고 이전 주사 부위 위에 다시 삽입합니다.
- 주입이 완료된 후 바늘을 올리기 전에 몇 초 정도 기다리십시오.
- 출혈 여부를 관찰하십시오. 출혈이 멈출 때까지 두 손가락을 사용하여 해당 부위에 적당한 압력을 가합니다.
- 동물을 새장으로 돌려보내십시오.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene 버킷 | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| 미세 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 젖산 링거병 솔루션 | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| 미니 소용돌 | Fisher Scientific | 128101 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 22624415 | |
| 실험실 필름 | Bemis | PM996 | |
| 1mL 주사기 | BD | 309626 | 25g 바늘이 부착된 상태로 제공됩니다. 주사용 바늘 27-30g 바늘로 교체 |
| 30g 바늘 | BD 305106 | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250mL |
| 마취 마스크 | Kopf Instruments | 906 | |
| 거즈 | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-0816 | |
| 마이크로피펫 | Gilson | 4642080 | |
| 가스 마취 기화기 | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| 가스 마취 청소부 | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| 가열 패드 | Sears | 17280 | |
| 벤치 패드 | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/ Harvard Apparatus | 76-0772 | 쥐 4마리/쥐 4 |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 프루프 |
| 70% 이소프로판올 | VWR | 89108-160 |
