동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 실험 동물을 위한 준비
공급업체
- 로부터 6-8주 된 야생형 C57BL/6JNarl 수컷 마우스를 입수합니다.
- 표준 마우스 차우와 멸균된 물이 있는 표준 마우스 케이지에 마우스를 자유롭게 보관합니다.
참고: 실험동물센터의 사육 조건은 온도 22± 1°C, 습도 55% ± 10%, 13시간/11시간의 빛/암흑 주기입니다.
2. 정위 수술
정
- 위 기구, 수술 기구 및 관련 품목을 준비하고 멸균합니다.
참고: 감염을 방지하기 위해 수술 부위에 직접 접촉하는 모든 품목을 멸균해야 합니다. - 산소 중 1%-5% 이소플루란이 있는 플렉시글라스 케이지에 마우스를 넣어 마우스를 마취합니다.
참고: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡수가 초당 약 한 번의 호흡으로 유지되는지 확인하십시오. - 마취실에서 마우스를 꺼냅니다. 애완동물 트리머로 수술 부위(마우스 머리)를 면도합니다. 정위 앞니 홀더의 앞니 막대에 마우스 앞니를 고정하여 마우스를 정위 프레임에 놓습니다. 노즈콘 마스크로 코를 덮습니다.
- 정위 수술 내내 산소 함량의 1%-2.5% 이소플루란으로 마우스를 마취시킵니다. 발가락 꼬집기 반사를 통해 마우스의 통각을 평가하고 수술 부위를 절개하기 전에 일정한 호흡수를 보장합니다.
- 수술 중 체온을 유지하기 위해 정위 고정 프레임의 마우스 아래에 가열 패드(37.0°C)를 놓습니다. 또는 프로그래밍된 워머와 가열 패드를 연결하는 직장 열 프로브를 사용하여 심부 온도를 유지하십시오.
- 접착 테이프를 사용하여 머리의 다듬어진 털을 제거합니다. 통증을 완화하기 위해 진통제 케토프로펜(5mg/kg)을 마우스에 피하 주사합니다. 안구건조증을 피하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
- 뾰족한 이어바를 외이도에 삽입하여 머리를 고정합니다.
- 이어바의 눈금을 조정하여 머리를 중앙에 놓습니다.
- 수직 움직임을 피하기 위해 앞니 홀더의 노즈 클램프를 조입니다. 머리를 부드럽게 눌러 머리가 고정되었는지 확인하고 후속 수술 중에 머리가 느슨해지지 않도록 하십시오.
- 면봉을 사용하여 클로르헥시딘 스크럽을 세 번 번갈아 가며 두피를 소독합니다. 각 스크럽을 중앙에서 바깥쪽으로 시작합니다(가장 소독된 중앙 영역에서 가장 덜 소독된 영역까지).
참고: 중간에서 바깥쪽으로 스크럽을 사용하면 과학자들이 모피로 인한 감염과 오염을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 바깥쪽 부위는 면도하지 않은 머리 부위에 가깝는데, 여전히 털이 많아 철저한 소독이 쉽지 않습니다. - 수술용 칼날을 사용하여 두피를 전방/후방(<1cm)으로 절개합니다. 절개 부위를 열고 미세해부 겸자로 잡은 면봉으로 두개골을 닦습니다.
참고: 미세해부 겸자, 수술용 칼날, 면봉은 수술 전에 고압멸균으로 멸균해야 합니다. 수술 과정에서 각 동물 전후에 최소 5초 동안 유리 구슬 멸균기(150°C)를 사용하여 모든 수술 장비를 멸균합니다. 수술 과정 중 및 동물 사이에 수술용 칼날과 겸자를 고정할 수 있도록 멸균된 비커를 준비하십시오. - 두개골에 있는 Bregma와 Lambda를 식별합니다. Bregma를 참조로 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
- 선택사항: 정위 드릴 홀더에 정위 드릴을 장착하고 드릴 끝을 사용하여 Bregma를 참조로 가리킵니다. 유리 구슬 멸균기(150°C)를 사용하여 최소 5초 동안 정위 드릴을 멸균합니다.
- Bregma/Lambda로 왼쪽/오른쪽 및 전방/후방 평면에서 평평한 두개골 수평면을 보정하고 정렬합니다.
참고: 올바른 수평면에 있지 않으면 정위 기구에 마우스를 다시 장착합니다.
3. 상업용 맞춤형 가이드 캐뉼라 이식
정
- 위 좌표를 기반으로 우측 심실의 위치를 식별하고 라벨링합니다: Bregma까지의 거리, 전방/후방(A/P): 0.26mm, 내측/외측(M/L): -1.0mm, 등쪽/복부(D/V): -2.0mm.
참고: 좌표는 관심 영역에 따라 수정할 수 있습니다. 측심실의 좌표는 체중 범위가 26-30g인 성인 C57BL/6J 마우스를 기반으로 했습니다. - 상업용 가이드 캐뉼라 이식을 위해 정위 드릴을 사용하여 라벨이 붙은 부위의 두개골을 통해 구멍(직경 = 1.5mm)을 뚫
습니다.- 스테인리스 스틸 나사 장착을 위해 정위 드릴을 사용하여 두개골에 2-4개의 구멍(직경 = 1.5mm)을 더 뚫습니다.
참고: 각 동물 전후에 최소 5초 동안 유리 구슬 멸균기(150°C)를 사용하여 정위 고정 드릴을 멸균합니다. - 뼈 조각을 닦고 면봉으로 출혈을 멈춥니다.
- 국소 마취, 항소양제 및 통증 완화 효과를 위해 면봉을 사용하여 리도카인(1mg/kg)으로 두개골을 닦습니다. 구멍을 뚫은 후에도 출혈이 멈추지 않으면 지혈을 위해 구멍에 면봉을 부드럽게 대십시오.
- 구멍에 2-4개의 스테인리스 나사를 장착하여 치과용 아크릴용 앵커를 제공합니다.
- 상업용 가이드 캐뉼라를 정위 고정 캐뉼라 홀더에 놓고 유리 구슬 멸균기(150°C)로 소독합니다.
참고: 상업용 가이드 캐뉼라, 상업용 더미 및 상업용 인젝터(그림 1A)는 재료 표에 표시된 사양으로 맞춤화되었습니다. - 정위 캐뉼라 홀더를 측심실용으로 뚫은 구멍으로 옮기고 원하는 깊이(2.5mm)가 될 때까지 상업용 가이드 캐뉼라를 구멍에 천천히 삽입합니다.
참고: 등쪽/복부 좌표는 팁이 구멍에 간신히 삽입되었을 때 상업용 가이드 캐뉼라의 끝을 기준으로 설정하여 정의할 수 있습니다. - 10μL의 n-부틸 시아노아크릴레이트 접착제(조직 접착 접착제)를 도포하여 상업용 가이드 캐뉼라를 드릴 구멍에 고정하고 3-4분 동안 기다립니다. 정위 고정 캐뉼라 홀더에서 상업용 가이드 캐뉼라를 부드럽게 분리하고 홀더를 멀리 옮깁니다.
- 절개된 두피에 치과용 아크릴을 도포하여 상업용 가이드 캐뉼라를 고정하고 최소 5분 동안 기다립니다. 혈액이나 체액에 의해 캐뉼라가 막히는 것을 방지하기 위해 상업용 더미를 상업용 가이드 캐뉼라에 이식합니다(그림 1B).
- 외이도에서 이어바를 풀고 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다.
- 마취에서 회복하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 새 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 계속 관찰합니다.
참고: 흉골 누운 자세를 유지할 수 있는 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌아와서는 안 됩니다. - IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜 및 실험 설계에 따라 마우스를 단일 하우징 또는 그룹 하우징으로 되돌립니다. 그룹 사육의 경우 원치 않는 부상이나 캐뉼라 분리를 최소화하기 위해 새장에 사육되는 쥐의 수를 줄
이십시오.- 수술 후 관리를 위해 최소 3일 동안 식수에 이부프로펜(0.2mg/mL)을 투여하고, 최소 3일 동안 통증과 고통의 징후가 있는지 하루에 두 번 모니터링합니다.
- 수술 후 관리 중에는 생쥐의 염증과 감염을 예방하기 위해 피부 주위에 록시스로마이신 연고를 바르십시오.
- 동물의 상태를 계속 모니터링하고 충분한 에너지를 제공하기 위해 5% 포도당 및/또는 0.9% 염화나트륨을 적시에 복강 주사합니다.
- 통증, 고통 또는 감염 상태가 꾸준히 악화되면 CO2 흡입으로 마우스를 안락사시킵니다.
- 마우스가 단쇄 지방산(SCFA)의 뇌실내 전달 및 행동 테스트를 위해 준비될 때까지 수술 후 1주일 동안 기다립니다.
4. SCFA의 제조
인공뇌척
- 수액(ACSF)에 아세트산나트륨, 부티르산나트륨, 프로피오네이트나트륨을 용해시킵니다( 재료 표 참조).
- 화학 물질이 완전히 용해되었는지 확인한 다음 pH를 7.4로 조정하고 멸균을 위해 0.22μm 필터를 통해 SCFA 혼합물을 여과합니다.
5. 행동 테스트 중 SCFA의 뇌실내 전달을 위한 주입 시스템 설정
천
- 장 카메라를 장착하여 행동을 기록합니다. 카메라를 컴퓨터와 연결하여 비디오 녹화 소프트웨어를 제어합니다(그림 2).
- 10μL 주사기에 증류수를 채웁니다.
참고: 마이크로리터 주사기에 기포가 생기지 않도록 하십시오. - 마이크로 인젝션 펌프를 마이크로 인젝션 컨트롤러와 연결합니다.
- 마이크로리터 주사기를 미세 주입 펌프에 장착합니다. 주사기를 설치하려면 버튼을 눌러 cl을 풉니다.amp 주사기를 해당 위치에 설치합니다. 클램프를 닫고 미세 주입 펌프의 플런저 고정 나사를 조입니다(그림 3A).
- 상업용 인젝터를 폴리에틸렌 튜브에 삽입합니다(그림 1A).
- 폴리에틸렌 튜브를 테스트 경기장 위의 천장 카메라에 걸어두세요.
- 인슐린 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브에 증류수를 채웁니다. 마이크로리터 주사기를 매달린 폴리에틸렌 튜브에 연결합니다.
참고: 폴리에틸렌 튜브가 마우스가 테스트 경기장 전체에서 자유롭게 움직일 수 있을 만큼 충분히 길지 확인하십시오.
6. 마이크로 주입 컨트롤러의 시스템 설정
- 마이크로 주입 컨트롤러를 켜고 모든 채널 표시를 눌러 명령 화면에 액세스합니다(그림 3C). Configuration(구성)을 누르고 Volume Target(볼륨 목표)을 9,800nL로 설정하고 Delivery Rate(전달 속도)를 100nL/s로 설정합니다. 마이크로리터 주사기에 연결된 폴리에틸렌 튜브에서 9,800nL의 증류수를 주입합니다(방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 RUN을 누릅니다)(그림 3C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
- 구성을 누르고 부피 목표를 3,000nL로 설정하고 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 3,000nL의 미네랄 오일을 회수합니다(Direction을 눌러 철회 모드로 전환하고 RUN을 누릅니다)(그림 3C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
참고: 폴리에틸렌 튜브에서 명확한 유수상 분리를 관찰해야 합니다. - 마이크로리터 주사기 바늘에서 폴리에틸렌 튜브를 분해합니다. 마이크로리터 주사기 바늘에서 3,000nL의 증류수를 뱉어냅니다(방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 실행을 누릅니다).
- 마이크로리터 주사기를 폴리에틸렌 튜브에 다시 삽입합니다. Configuration(구성)을 누르고 Volume Target(볼륨 목표)을 9,500nL로 설정하고 Delivery Rate(전달 속도)는 100nL/s입니다. 9,500nL의 SCFA를 인출합니다(Direction을 눌러 인출 모드로 전환하고 RUN을 누릅니다). SCFA가 성공적으로 주입되었는지 확인하기 위해 오일-SCFA 단계에 라벨을 붙입니다.
- Configuration(구성)을 누르고 Delivery Rate(전달 속도)로 원하는 볼륨 목표를 7nL/s로 설정합니다. Direction(방향)을 눌러 주입 모드로 전환합니다(그림 3C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
참고: 주입 시간에 따라 볼륨을 결정합니다. 예를 들어, 전달 속도가 7nL/s인 경우 주입 시간이 3분인 경우 목표 부피 = 1,260nL입니다. - SCFA 주입을 위해 인젝터를 캐뉼라에 삽입하기 전에 RUN을 눌러 상업용 인젝터의 앞쪽 끝에서 액체가 나올 때까지 마이크로리터 주사기를 앞으로 주입합니다.
7. 자유롭게 움직이는 마우스의 상업용 가이드 캐뉼라를 통해 측심실에 SCFA 주입
산
- 소 중 1%-5% 이소플루란과 함께 플렉시글라스 케이지에 마우스를 넣어 마우스를 마취합니다.
참고: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡수가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인합니다. - 마우스를 목덜미로 쥐고 상업용 인젝터를 상업용 가이드 캐뉼라에 삽입합니다(그림 3B).
참고: 상업용 가이드 캐뉼라가 혈액이나 체액에 막힌 경우 핀셋으로 부드럽게 막히십시오. - 행동 테스트 전에 케이지에서 15분 동안 마우스가 마취에서 회복되도록 합니다.
- 기본 이동 테스트의 경우, 마우스를 새로운 케이지에 넣고 35분 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다. 처음 5분 동안 2,100nL의 목표 부피에 대해 7nL/s의 전달 속도를 사용하여 SCFA를 주입합니다(주입 모드로 방향을 누르고 실행을 누릅니다).
참고: 새로운 새장의 이동은 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. - 마우스를 마취하고(7.1단계 반복) 상업용 가이드 캐뉼라에서 상업용 인젝터를 제거합니다.
참고: 마우스는 이전 주사를 씻어낼 수 있는 적절한 시간을 준 후 다른 대조군/대사산물을 반복적으로 주사할 수 있습니다. 캐뉼라가 마우스 머리에 고정되어 있는 한 마우스는 다양한 대사 산물로 반복적으로 테스트할 수 있습니다.
8. 미세주입 시스템 복원
- 마이크로리터 주사기에서 폴리에틸렌 튜브를 분해합니다.
- 인슐린 주사기를 사용하여 튜브에 공기를 주입하여 폴리에틸렌 튜브의 증류수를 버립니다. 마이크로리터 주사기를 비우십시오.
- Configuration(구성) 화면에서 Reset Pos(위치 재설정)를 눌러 Syringe Stop Figure Definition(주사기 정지 그림 정의) 화면을 엽니다(그림 3C).
- 경고음이 날 때까지 철회를 눌러 미세 주입 펌프를 완전히 철회 위치로 재설정합니다(그림 3C).
- 명령 화면으로 돌아가서 이 화면에 **END REACHED** 기호가 있는 경우 마이크로 주입 컨트롤러를 끕니다(그림 3C).
