척수 손상 후 축삭 재생을 위한 Schwann 세포 파종 도관

초록

출처: Lee, Y., et.al. 절개된 쥐 척수 그루터기를 연결하기 위해 절개된 쥐 척수 그루터기를 연결하기 위해 PVDF-TrFE 도관 내부에 슈완 세포를 이식하여 간격을 가로질러 축삭 재생을 촉진합니다. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 절개된 쥐 척수에서 축삭 재생을 촉진하기 위해 Schwann 세포로 파종된 압전 고분자 도관의 사용을 보여줍니다. 도관은 구조적 안내를 제공하는 반면, 생체전기적 특성은 신경돌기 성장을 자극합니다. 도관 내의 슈완 세포는 신경영양 인자를 분비하여 주둥이와 꼬리 그루터기 사이의 축삭 가교를 지원합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. T8에서 절<

ol style='list-style-type:decimal;'>

T7에서 T9 주위에 견인기를 배치합니다. 모든 laminae가 제거되면 특히 T8에서 가로 돌기 사이의 간격이 보이는지 확인하십시오. 또한 T7에서 T9 사이의 양쪽 길이를 따라 뼈를 검사하여 바깥쪽으로 돌출된 뼈 조각이 없는지 확인하십시오.
참고: T8의 이 간격은 완전한 절단을 수행하는 데 중요합니다. 도관 삽입을 더 쉽게 할 수 있도록 길이를 따라 척추뼈를 제거해야 합니다.

각진 스프링 가위를 사용하여 T8 위와 아래의 등쪽과 복부 뿌리를 자릅니다. 척수에 식염수를 넣고 혈액이 응고될 때까지 기다립니다.
참고: 이 단계는 적절한 도관 삽입을 위해 중요합니다.

각진 스프링 가위를 척수 위의 T8 가돌기 사이의 틈에 놓고 척수를 완전히 절단하기 위해 한 번 자릅니다. 압축된 폼의 작은 조각을 결과 2-2.5mm 간격에 놓고 즉시 해당 부위에 식염수를 추가합니다.

2. 도관 삽입

1. 절단된 탯줄 그루터기가 지혈에 도달할 때까지 기다리는 동안 1x PBS에서 도관을 꺼냅니다. 흡수 삼각형을 얇고 긴 조각으로 자르고 도관에 넣어 과도한 PBS를 제거합니다. 미리 절단된 창이 열려 있는지 확인하십시오.
얇
2. 고 긴 흡수 삼각형 조각을 사용하여 식염수와 혈액을 제거합니다. 잘 분리되도록 미세 주걱을 사용하여 척수의 두 그루터기를 들어 올립니다. 마이크로 주걱으로 그루터기를 부드럽게 들어 올리고 창문이 자신을 향하도록 도관을 그루터기 위로 밀어 넣습니다. 그루터기 전체가 삽입되었고 도관에 과도한 출혈이 없는지 확인하십시오.
3. 꼬리 그루터기를 부드럽게 들어 올리고 도관의 다른 쪽 끝을 그루터기 위로 밀어 넣습니다. 전체 그루터기가 삽입되고 창이 등쪽 표면에 있는지 확인하십시오(그림 1A).

3. 슈완 세포(SC)/주사 가능한 매트릭스 준비 및 주입

1. 절단된 탯줄이 지혈에 도달할 때까지 기다리는 동안 GFP-SC 펠릿 위의 배지를 제거합니다. GFP-SC를 10μl의 차가운 DMEM/F12에 재현탁합니다. 세포 현탁액에 10μl의 냉주사 가능한 젤을 첨가하고 반복적인 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 도관 삽입이 완료될 때까지 GFP-SC/DMEM/F12/주사 가능한 매트릭스 혼합물을 얼음 위에 보관합니다.
2. 등쪽 표면의 창이 열려 있는지 확인한 후(그림 1A), 웨스턴 블롯 로딩 팁과 마이크로피펫을 사용하여 미리 절단된 창 중 하나를 통해 GFP-SC/DMEM/F12/주입 가능한 매트릭스 혼합물 20μl를 도관에 주입합니다. SC/DMEM/F12/주사 가능한 매트릭스 혼합물이 도관을 과도하게 채워야 하는 경우 흡수 삼각형으로 초과분을 제거합니다. 주입 후 창문을 닫으십시오. 봉합이 필요하지 않습니다(그림 1B).

결과

그림 1: SC/DMEM/F12/매트릭스 주입 후 창 닫힘. 주둥이와 꼬리 그루터기(A) 사이에 도관을 배치한 후 각 플랩을 뒤로 접어 창을 엽니다. 주입 후 창문이 닫힙니다(B). 스케일 바 = 1mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지: 영양 혼합물 F-12	ThermoFisher Scientific	11039-021	"DMEM/F12" 프로토콜에서.
암컷 피셔 쥐 (160-180g)	Envigo
Vannas 가위, 스트레이트	FST	15018-10
마이크로 주걱	FST	10089-11	브랜드를 선택할 수 있습니다.
끝이 뭉툭한 곡선 가위	FST	14017-18	브랜드를 선택할 수 있습니다.
무딘 겸자	FST	11006-12	브랜드든 선택할 수 있습니다.
Rongeur	FST	16121-14	브랜드를 선택할 수 있습니다.
각진 스프링 가위	FST	15006-09	브랜드를 선택할 수 있습니다.
흡수 삼각형	FST	18105-03	모든 브랜드를 선택할 수 있습니다.
Gelfoam	Henry Schein	9083300	프로토콜의 "압축 폼".
#10 블레이드	Sklar	06-3010	브랜드든 선택할 수 있습니다.
Matrigel	Corning	354234	프로토콜의 "주사 가능한 매트릭스".

모든 모든 어떤 모든 모든 어떤