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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 설치류 정맥 카테터 삽입, 바이러스 전달 및 광섬유 이식
- 수술을 위해 동물을 준비합니다.
- 제도적 지침에 따라 선택한 마취제로 쥐를 완전히 마취합니다. 한 가지 옵션은 케타민 염산염(87.5-100 mg/kg, 근육 주사[i.m.]) 및 자일라진 염산염(5 mg/kg, i.m.)입니다. 발가락 꼬집기 반사가 없는지 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
주의: 케타민은 기관 지침에 따라 취급해야 하는 규제 물질입니다.
참고: 마취제의 근육 주사는 복강내 주사보다 더 빠르고 신뢰할 수 있는 마취 유도를 생성하기 때문에 이 연구에서 사용됩니다. 쥐의 호흡과 반응성을 지속적으로 모니터링하고 수술 내내 열 지원을 제공합니다. - 쥐의 등의 넓은 부위(견갑골 바로 위에서 등 중앙까지 등 위쪽)와 오른쪽 앞다리 아래 목 부위, 두피를 면도합니다.
- 쥐를 수술 부위에 놓고 눈에 푸랄루브(인공 눈물)를 바르십시오. 등 위쪽 피부를 통해 체중량의 카프로펜(진통제)을 피하(피하[s.c.])주사한 다음 젖산 링거 용액 5mL를 허리 피부를 통해 피하(피하[s.c.])주입합니다.
- 멸균 거즈 조각을 베타딘으로 적시고 원을 그리며 면도한 수술 부위를 닦아 모든 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 70% 에탄올로 이 과정을 반복합니다. 이 교대 주기를 세 번 반복합니다.
- 이전에 발표된 프로토콜에 따라 정맥 카테터 이식을 수행합니다.
참고: 카테터 이식 중 자극을 피하기 위해 이 수술 중에는 수술용 드레이프를 사용하지 않습니다. 사용하기 전에 모든 기구와 장비를 소독하십시오. 멸균 장갑을 사용하고 멸균되지 않은 표면이 닿으면 장갑을 교체하십시오. - 카테터 이식 직후 쥐를 정위 프레임에 고정하여 아데노 관련 바이러스(AAV) 주사를 수행합니다.
- 국소 마취제로 2% 리도카인(0.2-0.3mL)을 두피에 피하(s.c.) 주사합니다.
참고: 수술 결과의 변화를 피하기 위해 정맥 카테터 이식 중에는 국소 마취제를 사용하지 않습니다. - 26게이지 스테인리스 스틸 주사 캐뉼라를 1μL의 농축 AAV 용액으로 채워진 Hamilton 주사기에 연결합니다: AAV5-hSyn-tdTomato 또는 AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
참고: oChIEF는 청색광 민감성 옵신 채널로돕신(ChR2)의 변종으로, 광범위한 주파수에 반응할 수 있으므로 이 프로토콜에서 논의된 저주파 장기 우울증(LTD) 실험에 유용합니다. 뿐만 아니라 고주파 장기 증강(LTP) 실험에도 사용됩니다. oChIEF 구조물은 Roger Tsien 박사가 기증했으며 Duke Viral Vector Core에서 포장 및 정제를 위해 처리되었습니다. 시상(MGN) 축삭 말단의 내측 슬상 핵에서 최적의 바이러스 발현을 허용하기 위해 주사일과 LTD 유도일 사이에 최소 3-4주가 필요합니다.
주의: 일반적으로 AAV는 도우미 바이러스를 생산에 사용하지 않는 한 자가 감염 위험이 낮은 생물안전성 레벨 1(BSL-1) 유기체로 간주됩니다. 이를 사용하려면 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인이 필요하며 불필요한 노출을 제한하기 위해 기관 지침에 따라 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 항상 사용해야 합니다. - 메스를 사용하여 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 0.5mm의 절개를 하고 그 위에 있는 조직을 제거하여 두개골 표면을 노출시킵니다.
- 쥐의 머리를 전/후 축으로 수평을 맞추고 정위 좌표를 브레그마에 0으로
고정합니다.- 작은 드릴 비트가 장착된 Dremel 도구를 사용하여 두개골에 세 개의 작은 구멍을 뚫습니다. 드라이버를 사용하여 스테인리스 스틸 나사(M2x4 965-A2)를 제자리에 단단히 장착합니다.
알림: 치과용 시멘트를 적절하게 묶고 견고하고 오래 지속되는 헤드캡을 만들려면 나사가 필요합니다. 나사의 위치는 두개골의 전후축을 가로질러 AAV 주사 부위에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. - 내측 슬상 핵(MGN)의 내측 부분에 대한 쥐 뇌 지도(Watson 및 Paxinos)의 좌표를 기반으로 AAV 주입을 위한 양측 구멍을 뚫습니다. bregma에서 mm, 전후방(AP): -5.4; 내측(ML): ±3.0; 배복부(DV): -6.6. MGN에 위치할 때까지 주사 캐뉼라(4mm/min)를 천천히 내립니다. 농축된 AAV 용액을 0.1 μL/min의 속도로 주입합니다.
- 주입이 완료된 후 주사 캐뉼라를 5분 동안 제자리에 두어 캐뉼라에서 멀리 확산되도록 한 다음 뇌에서 캐뉼라를 천천히 빼냅니다.
- 바이러스 주입 직후 MGN-LA 단자를 표적으로 하는 광섬유를 계속 이식합니다.
- Dremel 도구를 사용하여 외측 편도체를 표적으로 하는 광섬유 임플란트용 양측 구멍을 뚫습니다(bregma에서 mm, AP: -3.0; ML ±5.1)입니다.
- 겸자를 사용하여 광섬유 임플란트의 페룰을 잡고 정위 어댑터에 고정하여 제자리에 단단히 고정합니다.
- 섬유의 끝이 LA의 등쪽 부분에 위치할 때까지 2mm/min의 속도로 섬유를 천천히 내립니다(배복부[DV]: -7.9mm).
먼저 - Loctite 순간 접착제의 얇은 층을 사용하여 페룰을 두개골에 고정한 다음 치과용 시멘트를 고정하고 직경 1.25mm의 페룰 슬리브와 먼지 덮개로 페룰을 덮습니다.
참고: 페룰을 두개골에 고정하기 위한 접착제 선택은 지역 또는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아야 합니다. 록타이트는 여러 접착제로 시행착오를 거친 후 페룰을 두개골에 안정적으로 고정하기 위해 이 연구에 사용됩니다. 그러나 사용 가능한 대안을 고려할 수 있습니다.
- 수술 후에는 쥐를 개별적으로 수용하고 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오. 기관 지침에 따라 수술 후 관리를 제공합니다. 개통성을 유지하기 위해 겐타마이신(5mg/mL)과 헤파린(30USP/mL)이 함유된 식염수로 매일 카테터를 세척하십시오. 수술 후 최소 5일 및 행동 실험 시작 24시간 전에 음식은 쥐를 자유 먹이 체중의 ~90%로 제한합니다.
2. 설치류 코카인 자가 투여 및 도구적 레버 소멸
참고: 모든 행동 절차는 한쪽 벽에 두 개의 개폐식 레버, 각 레버 위의 자극 조명, 톤 제너레이터, 하우스 라이트 및 주입 펌프가 장착된 표준 조작 조절 챔버에서 수행됩니다.
- 고정 비율 일정 1(FR1) 강화 일정에 따라 쥐에게 매일 1시간 코카인(2mg/mL) 자가 투여 훈련 세션을 실시합니다.
매일 - 조작성 챔버에 쥐를 넣고 쥐가 레버를 누르도록 합니다. 지정된 '액티브 레버'(왼쪽 및 오른쪽 레버에 걸쳐 균형 잡힌 레버)를 누르면 코카인 주입(1.0mg/kg/주입)이 발생하고 복합 조명 및 톤 큐가 10초 동안 표시됩니다. 지정된 '비활성 레버'를 눌러도 프로그래밍된 효과가 없습니다.
- 최소 10일 동안 쥐가 연속 3일 동안 하루에 최소 8회 주입을 성공적으로 얻을 때까지 자가 투여 실험을 계속합니다. 20일까지 획득 기준에 도달하지 못하면 연구에서 제외됩니다.
- 획득 기준이 성공적으로 충족된 후, 쥐를 6-10 d.
쥐- 를 조작성 챔버에 넣고 쥐가 자유롭게 레버를 누를 수 있도록 합니다. 그러나 활성 및 비활성 레버 모두에 대한 응답은 프로그래밍된 결과를 가져오지 않습니다.
- 쥐가 연속 2일 동안 평균 25번의 레버 누름이 발생할 때까지 매일 도구적 멸종을 계속하게 < 합니다.
3. LTD의 생체 내 광유전학적 유도
참고: 광유전학적 억제 실험은 기기 소멸의 마지막 날 후 24시간 후에 수행됩니다.
- 덮개를 제거한 깨끗한 표준 설치류 하우징 케이지 위에 매달린 회전 조인트를 통해 패치 코드를 473nm 청색 레이저 다이오드에 연결합니다. 이 설정을 통해 설치류는 광유전학적 자극 중에 케이지 주위를 자유롭게 이동할 수 있습니다.
- 사용 설명서에 따라 레이저 다이오드를 켜고 펄스 발생기에 연결하십시오. 쥐를 켤 때 쥐가 900Hz에서 2ms 광 펄스를 1회 수신하도록 설정을 조정합니다.
주의 : 레이저를 작동하는 동안 항상 적절한 눈 보호 장치를 사용해야 합니다. - 광 센서를 사용하여 패치 코드를 통해 광도를 측정합니다. 패치 케이블을 통한 광 출력이 ~5-7mW가 되도록 레이저의 강도를 조정합니다.
- 쥐를 깨끗한 사육 케이지에 넣으십시오. 먼지 덮개와 페룰 슬리브를 제거하여 페룰을 노출시킵니다. 패치 코드를 광섬유 임플란트에 양측으로 연결합니다. LTD 유도 전에 쥐가 3분 동안 환경을 탐색하도록 합니다.
- 펄스 발생기를 켜서 광유전학적 자극을 시작합니다.
참고: 가능성은 낮지만 쥐가 자극에 대해 부작용을 경험하면 실험을 즉시 종료하고 쥐는 제도적 지침에 따라 적절하게 안락사됩니다. - LTD 유도 후 쥐를 3분 동안 우리에 가둔 다음 다시 집 우리에 넣습니다.
- 대조군 실험의 경우, AAV5-td토마토 대조군 바이러스를 발현하는 쥐에 대해 동일한 자극 절차를 사용합니다. 가짜 실험의 경우, AAV5-oChIEF 바이러스를 발현하는 쥐의 광섬유에 패치 코드를 부착하지만 15분 세션 동안 자극이 전달되지 않습니다.
4. 단서 유도 코카인 탐색에 대한 광유전학적 자극의 효과를 테스트
합니다
- 생체 내 광유전학적 자극 후 24시간 후에 쥐를 조작적 컨디셔닝 챔버에 다시 넣습니다. 쥐는 코카인 탐색 행동을 평가하기 위해 1시간 표준 단서 유도 복원 세션을 받습니다.
참고: 단서 유도 복원 중에 활성 레버에 대한 반응은 코카인 관련 단서의 10초 프레젠테이션을 생성하지만 코카인 주입은 생성하지 않습니다. - 광유전학적 LTD 유도가 코카인 탐색의 장기적인 억제로 이어지는지 확인하기 위해 첫 번째 검사 후 최소 1주일 후에 두 번째 복직 검사를 실시
하십시오.