이 프로토콜은 MG (II) - 종속 히드록실 급진 footprinting 두 가지 방법으로 RNA 차 구조 형성을 계량하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
'Peroxidative'와 '산화'히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
RNA의 분자 생물학에서 필수적인 역할을한다. 유전 정보를 전달하는 이외에, RNA는 레귤레이터, 바인더 또는 촉매와 같은 특정 생물 학적 역할을 수행 고유한 삼차 구조로 접을 수 있습니다. 차 접촉 형성에 관한 정보는 RNA 분자의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 히드록실 래디 칼 (• OH)가 높은 반응과 작은 크기로 인해 핵산의 구조 독특한 프로브입니다. 1 footprinting 프로브로 사용하면, 히드록실 래디 칼과 함께 DNA 1과 RNA 2의 phosphodiester 백본의 용매 접근 표면을지도 단일 뉴클레오 티드 해상도만큼 괜찮아요. 히드록실 라디칼 footprinting는 DNA - 단백질 1과 RNA - 단백질 단지의 예 분자간 접촉면 내에 세포핵을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 평형 3 번과 4 번 전환 운동은 soluti의 함수로 수산기 라디칼 footprinting을 실시하여 확인할 수 있습니다에서 변수 또는 시간을 각각. footprinting의 주요 기능은 프로브에게 노출 제한 (예 : '싱글 히트 속도론') 폴리머의 각 염기의 유니폼을 샘플링 결과입니다 5.
이 비디오 문서에서, 우리는 RNA 샘플의 준비와 MG (II) - 중재 접는 등온선의 결정을 설명하기 Tetrahymena ribozyme의 P4 - P6 도메인을 사용합니다. 우리는 H 2 O 2 (우리가이 'peroxidative'프로토콜 호출)와 자연스럽게 녹아 O 2를 사용하는 귀중한하지만, 널리 알려진 아니라, 대안을 (우리가 부르는 '가 필요합니다 잘 알려진 수산기 라디칼 footprinting 프로토콜의 사용을 설명 산화 '프로토콜). 데이터 감소, 변환 및 분석 절차의 개요가 제공됩니다.
프로토콜
1. Footprinting의 시약의 준비
- 100 MM 나트륨 cacodylate, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M KCl을 포함 10X 반응 버퍼를 준비합니다. 7.4로 산도를 조정합니다. 0.2 μm의 아세테이트 필터 장치 (Nalgene)를 사용하여 버퍼를 필터링합니다. 비고가 : 10X 버퍼에 직접 pipet의 RNA를하지 않습니다.
- 로 표 1에 표시된 각 반응에 대한 적정 반응 믹스를 준비합니다. 적정 믹스의 볼륨 (원하는 농도에 1X 버퍼와 MG (II)는) 1X 버퍼에서 RNA의 10μl를 추가하기 전에, 90 μl해야합니다.
- 6.63M 요소, 20mM 나트륨 구연산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1mM, 0.25 μg / μl tRNA, 0.025 %의 크실렌의 cyanol, 그리고 0.025 %의 bromphenol 블루를 포함하는 RNAse T1의 소화 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼는 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 펜톤 반응은 250 MM 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 500 MM 나트륨 L - 아스코 브 산의 신선한 수성 솔루션을 필요로....
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토론
히드록실 급진 footprinting는 핵산의 용매 접근 표면적을 평가하는 유용한 도구입니다. 차 구조 14 질적 및 양적 형성은 이러한 이온 종류와 농도, 산도, 온도, 바인딩 단백질이나 접는 공동 요인으로 매개 변수의 함수로 다음 수 있습니다. 정직하고 저렴한 프로토콜과 그 결과 용매 접근성 및 단일 뉴클레오 티드 수준에서 접는 정보의 강력한 조합이 방법은 매우 매력적합니다. 전통적 • OH의 footprinting 반응은 H 2 O 2, 우리는 (그림 1A) 'peroxidative'으로 참조 프로토콜을 추가를 사용하여 수행됩니다. 우리가 강조하는 대안 ( '산화') 프로토콜 17 자연스럽게 반응을 통해 과산화수소의 소량 생산 O 2를 해산 활용
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 RO1 - GM085130 국립 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) MCB0929394에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 그녀의 환대와 그녀의 실험실에서 영화 우리에게 허용에 대한 박사 메리언 슈미트 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Sodium Cacodylate(주의! 독성) | Sigma-Aldrich | C4945-25g | |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G | |
| DEPC 처리수 | Ambion | AM9915G | |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 | |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G | |
| Urea | Ambion | AM9902 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R-7876 | |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631-25g | |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma-Aldrich | F1543-500g | |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 | |
| 과산화수소 (30%) | Sigma-Aldrich | 349887 |
참고문헌
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R.
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재인쇄 및 허가
