신경근 접합부 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상 유도

초록

출처: Dalkin, W., et al. 비골 신경 손상 방법: 신경근 접합부를 복구하는 요인을 식별하고 테스트하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법입니다. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 신경근 접합부(NMJ) 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상을 유도하는 수술 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 비골 신경을 노출시키고, 통제된 압력을 가하여 손상을 유도하고, 축삭 재생을 지원하기 위해 신경외막이 손상되지 않도록 하는 것이 포함됩니다. 시간이 지남에 따라 대식세포는 축삭 파편을 제거하여 신경 복구와 NMJ의 재건을 촉진합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술을 위한 동물 준비

1. 멸균 1ml 인슐린 주사기를 사용하여 피하 사타구니 주사를 통해 케타민(90mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물로 마우스를 마취시킵니다. 운반 용액에는 0.9% 식염수, 17.4mg/ml 케타민 및 2.6mg/ml 자일라진의 혼합물이 포함되어 있습니다. 약물이 효과를 발휘할 때까지 기다리는 동안 동물을 케이지에 다시 넣으십시오.
   참고: 부하 용량이 시술 기간 동안 충분한 마취를 제공하지 않으면 부하 용량의 25%를 추가로 주입할 수 있습니다.
2. 주사 후 동물을 모니터링하여 일정한 호흡수와 각성 수준의 적절한 감소를 확인합니다. 뒷발을 꼬집어 각성 수준을 확인하는데, 이는 충분히 마취되었을 때 반응을 이끌어내지 않아야 합니다.
   참고: 이것은 일반적으로 평균 25-30g의 젊은 성인 마우스의 경우 3-5분이 소요됩니다. 주사 후 10분 후에도 동물이 여전히 반응하는 경우 마취 부하 용량의 25%를 추가로 주입할 수 있습니다.
건조
3. 함을 방지하기 위해 바셀린과 가벼운 미네랄 오일 안과 연고를 동물의 눈에 바르십시오. 케이지에서 동물을 꺼내 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다. 전기 헤어 트리머를 사용하여 발에서 골반까지 원하는 뒷다리를 면도하여 팔다리의 측면만 노출시킵니다.
4. 면도한 부위에 화학 제모제를 1분 동안 바릅니다. 실험실 물티슈를 사용하여 수동으로 모발을 제거합니다. 에탄올에 적신 실험실 물티슈로 제모 부위를 청소하십시오.

2. 수술 절차

:

1. 오토클레이브 또는 기타 적절한 방법을 통해 수술 기구를 멸균합니다. 수술 부위와 수술 보드를 80% 에탄올/H₂O로 청소하고 프로비돈으로 수술 부위를 소독합니다. 마우스를 수술용 보드에 놓고 사지 구속 장치에 맞춥니다. 내부 또는 외부 회전 없이 무릎 관절을 약간 펴고 대상 뒷다리를 해부학적으로 자연스러운 위치에 유지합니다.
2. 동물과 보드를 수술용 현미경 아래에 놓습니다. 표면 랜드마크, 특히 뼈 무릎 관절과 전경골근과 비복근 사이의 능선의 촉진을 통해 적절한 절개 부위를 향합니다.
메
3. 스나 스프링 가위를 사용하여 피부를 약 3cm 절개하고 일반 집게를 사용하여 잡습니다. 총비골 신경의 기본 과정에 수직으로 절개하십시오.
4. 표재성 근막을 통해 절개를 계속하여 대퇴이두근과 외측광근을 노출시킵니다. 연결된 심부 근막을 절단하여 이 근육을 분리합니다. 1-2cm 컷이면 충분합니다.
5. 기계적 견인기를 사용하여 대퇴이두근을 꼬리쪽으로 후퇴시켜 총비골 신경을 드러냅니다.
6. 비복근의 외측 머리 힘줄과의 교차점이 발견될 때까지 신경을 근위부로 추적합니다.
   참고: 노출은 수축된 피부와 근육의 추가 조작이 필요할 수 있습니다. 이 교차점은 신경 손상의 안정적인 랜드마크로 사용됩니다.
7. 가는 집게로 신경을 잡고 끝을 비복근 힘줄의 측면 경계에 평행하게 정렬합니다. 5초 동안 꾸준하고 강한 압력을 가하여 총비골 신경을 분쇄합니다.
8. 수술 내시경을 통한 육안 검사로 신경의 완전한 압착을 확증합니다. 부상 부위에 반투명하게 나타납니다. 말초 축삭에서 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하면 손상 부위에서 형광이 사라집니다.
9. 견인기를 제거하고 해부학적 위치에서 근육을 재정렬합니다. 6-0 실크 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 1-3개의 단순 단속 봉합사로 충분합니다. 깨끗한 케이지의 가열 패드 위에 회복 마우스를 놓습니다.
10. 수술 후 2시간 동안 모든 동물을 모니터링하여 호흡 및 마취에 대한 부작용을 확인합니다. 수술 후 회복 직후 피하 사타구니 주사를 통해 부프레노르핀 0.05-0.10 mg/kg의 초기 용량을 투여합니다. 다음 48시간 동안 12시간마다 3회 추가 용량을 투여합니다. 완전히 회복된 후 쥐를 동물 보호 시설로 돌려보냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	VetOne	501072
자일라진	로이드 Inc.	3437
부프레노르핀	주팜	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
전기 면도기	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% 프로비오딘
1ml 인슐린 주사기
스프링 가위	Vannas	91500-09
No. 15 메스	Braintree Scientific	SSS 15
#5 겸자	Dumont	11252-00
6-0 실크 봉합사 반대 절단 바늘	봉합사 Express	752B
설치류 가열 패드	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 공액 알파-BTX	분자 프로브	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus 스테레오 줌 현미경	Olympus	562037192
Zeiss 700 공초점 현미경	Zeiss
가변 유량 연동 관류 펌프	Fisher Scientific	13-876-3