하이드로겔 기반 마이크로컬럼을 이용한 미세조직 공학 신경망 개발

초록

출처: Struzyna, LA 외, 신경계 재건, 변조 및 모델링을 위한 해부학적으로 영감을 받은 3차원 미세 조직 공학 신경망. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 세포외 기질 코어가 있는 하이드로겔 마이크로 컬럼을 사용하여 미세 조직 공학 신경망의 개발을 보여줍니다. 시드된 신경 응집체는 부착하고, 투영을 확장하며, 구조화된 신경망을 형성하여 신경 발달 및 신경치료 연구의 발전에 기여합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 아가로스 하이드로겔 개발(미세 조직 공학 신경망(micro-TEN)의 무세포 구성 요소)아

1. 가로스 용액 준비
   1. 생물 안전 캐비닛 내에서 20mL의 Dulbecco's phosphate-buffered 식염수(DPBS)를 두 개의 10cm 페트리 접시 각각에 옮겨 마이크로 컬럼용 저장소를 준비합니다. 뜨거운 구슬 살균기로 미세한 집게와 마이크로메스를 소독합니다.
   2. 아가로스 3g의 무게를 측정하고 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 비커로 옮깁니다. 3% 중량/부피(w/v)의 최종 농도를 위해 DPBS 100mL를 첨가합니다. 깨끗한 마그네틱 바를 포함하고 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다.
   3. 핫 플레이트/교반기를 사용하여 비커를 100°C로 데우고 120-200rpm으로 저어주어 아가로스를 완전히 용해시킵니다(용액이 탁함에서 투명함으로 변함). 겔화를 방지하기 위해 가열 및 교반을 유지하고 아가로스가 타지 않도록 필요에 따라 가열 온도를 변경하십시오.
      참고: 레이저 절단 장치와 모세관을 모두 사용한 제조는 각각 아래 하위 섹션 1.2 및 1.3에 나와 있습니다. 하위 섹션 중 하나에 설명된 단계를 완료한 후 하위 섹션 1.4로 진행합니다. 두 마이크로 컬럼 제조 방법 모두 아가로스가 냉각되면서 빠르게 응고되므로 액체 아가로스를 빠르게 첨가하십시오. 다음 단계 중 하나에서 오토클레이브로 멸균할 때는 유리 제품에 적용되는 표준 조건을 사용하십시오.
2. 레이저 절단 장치를 사용한 마이크로 컬럼 준비
   참고: 레이저 절단 장치는 상업용 CO₂ 레이저 절단기를 사용하여 투명 아크릴에서 절단됩니다. 레이저 절단을 통한 구조 및 장치 제작은 다양한 엔지니어링 및 연구 응용 분야에 대해 잘 문서화되어 있습니다. 이 금형(그림 1)은 각각 직경이 398μm이고 길이가 6.35mm인 5개의 원통형 채널 배열로 구성됩니다. 이 원통형 배열은 길이를 따라 각각 그림 1A 및 1B와 같이 아래쪽 절반(길이: 25.4mm, 너비: 6.35mm, 높이: 6.0mm)과 위쪽 절반(길이: 31.5mm, 너비: 6.35mm, 높이: 12.7mm)의 두 조각으로 형성됩니다. 두 개의 절반은 그림 1C에서 관찰된 전방 및 후방 캡(길이: 31.5mm, 너비: 6.35mm, 높이: 12.7mm)으로 함께 고정할 수 있으며, 상단 및 하단 조각에 각각 두 개의 구멍과 일치하는 4개의 정렬 구멍이 있으며 나사로 고정할 때 모든 부품을 함께 고정하는 데 도움이 됩니다. 이 캡에는 또한 원통형 채널과 동심원인 5개의 구멍이 포함되어 있으며, 침술 바늘을 삽입하여 마이크로 컬럼의 내강을 형성할 수 있습니다.
   1. 그림 1에 표시된 장치를 알루미늄 호일로 덮고 고압멸균하여 멸균합니다. 그림 1D와 같이 전방 및 후방 캡을 아래쪽 절반 부분에만 정렬하고 하단 정렬 구멍에 두 개의 #4-40 나사와 너트(나사 직경: 3.05mm)로 세 부분을 고정하여 장치를 조립합니다.
   2. 침술 바늘(직경: 180μm, 길이: 30mm)을 장치의 전방 또는 후방 캡에 있는 바늘 구멍에 완전히 삽입합니다(그림 1D). 마이크로피펫을 사용하여 원통형 채널 절반 각각을 완전히 채울 수 있도록 충분한 액체 아가로스(5개 채널의 경우 ~1mL)를 하단 절반에 붓습니다.
   3. 즉시 장치의 위쪽 절반 부분을 아래쪽 절반 위에 놓고 원통형 채널을 완성하기 위해 제자리에 단단히 고정될 때까지 압력을 가합니다(캡과 상단 부분 사이의 마찰로 인해 후자가 제자리에 유지됨). 아가로스 첨가 후 실온에서 ~5분 동안 기다렸다가 장치 채널 내부에서 겔화될 수 있도록 합니다.
   4. 장치 캡의 각 구멍에서 바늘을 수동으로 추출합니다. 나사를 제거하고 두 개의 캡과 위쪽 절반을 아래쪽 절반 조각에서 수동으로 분리하여 후자가 하이드로겔 마이크로 컬럼을 고정합니다.
   5. 미세한 집게를 사용하여 아래쪽 절반 조각의 채널에서 마이크로 컬럼을 부드럽게 제거하고 DPBS가 포함된 미리 준비된 페트리 접시에 넣습니다(단계 1.1.1). 또 다른 마이크로 컬럼 제작을 위해 장치를 재활용하십시오. 하위 섹션 1.4로 진행합니다.
3. 모세관을 사용한 마이크로 컬럼 제작<ol style='list-style-type:decimal;'>
4. 유리 모세관(직경: 398.78μm, 길이: 32mm)을 생물안전 캐비닛 내부로 옮깁니다. 긴 튜브를 수동으로 2.0-2.5cm 조각으로 부수고 침술 바늘 1개(직경: 180μm, 길이: 30mm)를 각 조각에 완전히 삽입합니다(그림 2A).
5. 비커에서 액체 아가로스 1mL를 빈 페트리 접시 표면으로 옮깁니다. 모세관과 도입된 바늘을 잡고 튜브의 한쪽 끝을 액체 아가로스 풀과 접촉시켜 모세관 작용으로 채웁니다. 모세관 상승을 촉진하기 위해 튜브를 교반하십시오.
   참고: 모세관 작용이 허용하는 한 높은 높이로 액체 아가로스로 모세관을 채우십시오. 그 후, 이러한 마이크로 컬럼은 원하는 길이에 따라 더 작은 구조로 절단될 수 있습니다. 1mL 아가로스 풀은 아가로스가 빠르게 냉각되고 겔화되어 추가 모세관 작용을 방지하기 때문에 일반적으로 하나의 튜브에만 사용됩니다.
6. 액체가 상승을 멈추면 수영장에서 모세관을 제거하고 페트리 접시 표면에 수평으로 놓습니다. 아가로스 겔이 튜브 내부에 가라앉을 때까지 5분 동안 기다리십시오.
7. 엄지와 검지를 튜브의 양쪽에 놓고 누릅니다. 다른 손을 사용하여 엄지와 검지를 사용하여 바늘을 빠르게 빼내어 마이크로 컬럼 자체가 튜브 밖으로 미끄러지는 것을 방지합니다. 모세관에 30게이지 바늘을 삽입하여 마이크로 컬럼을 DPBS가 들어 있는 접시로 천천히 밀어 넣습니다(단계 1.1.1).

마이크로 컬럼 트리밍 및 멸균

1. 미세한 집게를 사용하여 DPBS에서 빈 접시로 마이크로 컬럼 하나를 섬세하게 옮깁니다. 건조를 방지하기 위해 마이크로피펫을 사용하여 마이크로 컬럼 상단에 10μL의 DBPS를 추가합니다. 시각적 안내를 위해 후자의 접시를 입체경 아래에 놓습니다.
   참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 마이크로 컬럼 건조 또는 탈수는 이러한 구조의 전형적이고 수화된 모양과 시각적으로 구별할 수 있는 구겨진 구조의 획득을 의미합니다. 탈수된 마이크로 컬럼은 페트리 접시 표면에 단단히 부착되어 쉽게 이동할 수 없는 반면, 수화된 구조물은 집게로 조작한 후 표면을 가로질러 미끄러지는 경향이 있습니다. 완전히 건조된 마이크로 컬럼의 위상차 이미지는 그림 3A에 나와 있습니다.
2. 마이크로 메스로 마이크로 컬럼을 다듬어 원하는 길이(여기서는 2-5mm)로 줄입니다. 미세한 집게로 트리밍된 마이크로 컬럼을 1.1.1단계에서 준비된 다른 DPBS 페트리 접시로 운반합니다.
3. 제조된 각 마이크로 컬럼에 대해 1.4.1 및 1.4.2단계를 반복합니다.
4. DPBS 함유 페트리 접시의 마이크로 컬럼을 자외선(UV) 하에서 1시간 동안 멸균합니다. 세포외 기질(ECM) 첨가 및 세포 도금 전에 페트리 접시를 4°C에서 보관합니다.

2. 1차 뉴런 배양 및 강제 세포 응집 방법

1. 피라미드 마이크로웰 어레이의 준비
   참고: 이 섹션에서는 그림 1E와 같이 원통형 베이스(직경: 2.2cm, 높이: 7.0mm)와 상단의 9개의 정사각형 피라미드(측면 길이: 4.0mm, 경사각: 60°)로 구성된 3D 프린팅 금형을 사용합니다. 상용 3D 프린터를 사용한 적층 제조 공정은 잘 문서화되어 있습니다. 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 금형을 설계할 수 있습니다. 그런 다음 결과 설계 파일을 3D 프린터용 도구 경로로 디지털 방식으로 변환할 수 있습니다. 프린터마다 사양이 다르며 그에 따라 3D 프린터 설정 및 작동 지침도 다릅니다.
   1. 3/32" 드릴 비트를 사용하여 10cm 페트리 접시 뚜껑 중앙에 있는 4 x 4 배열(측면 길이: 4cm, 구멍 간격: 1cm)에 16개의 구멍을 뚫습니다. 화학 흄 후드 내부에서 페트리 접시의 바닥 부분을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 27g과 경화제 3g(1:10 비율)의 무게를 잰다. 마이크로 주걱으로 저어주어 약제가 고르게 분포
   되도록 합니다.
   2. 구멍이 뚫린 뚜껑으로 PDMS/경화제를 덮습니다. 호스의 한쪽 끝을 퓨머 후드의 진공 포트에 연결하고 다른 쪽 끝을 깔때기의 줄기에 삽입합니다(입 직경: 10cm, 줄기 길이: 3cm, 줄기 직경: 1.5cm).
   3. 1mL 피펫 전구 상단에 3/32" 드릴 비트로 구멍을 만들고 1,000μL 마이크로피펫 팁을 구멍에 삽입하여 고정합니다(뾰족한 끝이 위쪽을 향하도록 함). 전구와 팁을 호스에 넣고 전구가 호스를 깔때기 줄기에 밀봉할 때까지 호스를 위쪽으로 당깁니다.
   4. 구멍이 뚫린 접시 뚜껑에 깔때기를 놓고 튼튼한 지지대로 호스를 고정합니다. 진공 밸브를 5분 동안 열어 흡입하고 기포를 표면으로 가져옵니다.
   5. 밸브를 닫고 깔때기를 제거한 다음 페트리 접시를 흄 후드 표면에 ~3번 두드려 남아 있는 기포를 터뜨립니다.
   피
   6. 라미드가 위를 향하도록 피라미드 웰 3D 프린팅 몰드를 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 플레이트의 각 웰이 채워질 때까지 PDMS/경화제를 금형 위에 붓습니다. 12웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 60°C에서 1시간 동안 오븐에 옮겨 건조시킵니다.
   7. 마이크로 주걱을 사용하여 플레이트에서 각 PDMS 마이크로웰 어레이(그림 1F)를 조심스럽게 제거합니다. PDMS 어레이를 알루미늄 호일로 덮고 고압멸균하여 멸균합니다. 생물안전 캐비닛 내부에서 12웰 플레이트의 각 웰에 하나의 마이크로웰 어레이를 삽입합니다(그림 2B).
2. 쥐 태아로부터의 피질 뉴런 분리
   생물
   1. 안전 캐비닛 내부의 4-6개의 10cm 페트리 접시(해부된 조직당 하나씩)에 ~20mL의 행크 균형 소금 용액(HBSS)을 추가합니다. 이 접시를 해부 후드에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 마이크로 메스, 가위, 겸자와 같은 해부 기구를 뜨거운 구슬 멸균기로 멸균합니다.
   2. 배아 뉴런 기초 배지 + 2% 무혈청 보충제 + 0.4 mM L-글루타민(이하 "배양 배지"라고 함) 및 0.25% 트립신 + 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 37°C에서 미리 데워 데옥시리보뉴클레아제(DNase) I을 실온에 두어 해동한다. HBSS에서 0.15 mg/mL DNAse I 용액 1.5 mL를 준비하고 얼음 위에 용액을 유지합니다.
   이
   3. 산화탄소 흡입으로 임신한 배아 18일째 쥐를 안락사시키고 참수로 사망을 확인합니다. 시체를 멸균 해부 후드로 옮기고 복부면이 위로 향하도록 눕힙니다. 70% 에탄올로 복부를 철저히 헹굽니다.
   4. 자궁을 열고 가위로 양막에서 태아(보통 ~11)를 제거하고 설명된 대로 겸자로 차가운 HBSS가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 입체경 아래에 차갑게(-20°C) 화강암 블록을 놓습니다. 해부 절차 전반에 걸쳐 HBSS의 저온을 보존하기 위해 이 콜드 블록의 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
   5. HBSS를 휘젓어 새끼를 헹구고 HBSS가 들어 있는 다음 깨끗한 접시로 옮깁니다. 입체경과 해부 기구를 사용하여 태아의 머리, 대뇌 반구 및 피질을 순차적으로 제거하고 각 해부 후 겸자로 각 조직을 새로운 HBSS로 채워진 접시로 옮깁니다.
   6. 파스퇴르 피펫으로 피질만 흡인하고 조직을 멸균 15mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 해부된 다른 조직은 버립니다. 혈청학적 피펫으로 ~5mL의 HBSS를 순차적으로 추가하고 제거하여 피질을 세 번 헹굽니다. 사용하지 않을 때는 튜브를 얼음 위에 놓으십시오.
   7. 파스퇴르 피펫을 사용하여 예열된 트립신-EDTA(트립신-EDTA 5mL당 4-6개 피질)가 들어 있는 15mL 튜브로 피질을 옮깁니다. 튜브를 수동으로 한 번 교반하고 37°C에 놓습니다. 조직이 뭉치는 것을 방지하기 위해 3분마다 튜브를 뒤집습니다.
   8. ~10분 후에 파스퇴르 피펫으로 조직을 제거하고 깨끗한 15mL 원심분리기 튜브로 옮겨 트립신에 대한 노출을 중지합니다. 0.15 mg/mL DNase I 용액(1.5 mL)을 피펫으로 튜브에 추가합니다.
   9. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 덩어리를 수동으로 분해한 다음 용액이 균질하게 나타나고 액체에 남아 있는 조직 조각이 없을 때까지 소용돌이(~30초)합니다. 용액을 완전히 균질화할 수 없는 경우 불용성 조각을 파스퇴르 피펫 끝으로 당겨
   추출합니다.
   10. 2.2.9단계에서 얻은 균질한 세포 용액을 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 펠릿화된 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상청액을 제거합니다. 혈청학적 피펫과 함께 배양 배지 2mL를 넣고 소용돌이치게 하여 세포를 재현탁시킵니다.
   11. 혈구계를 사용하여 단계 2.2.10에서 준비된 용액 중의 세포 수를 계산하고; 예상 수율은 3.0-5.0 x 10⁶ 세포/피질 반구입니다. 배양 배지에 1 mL 이상의 세포 현탁액을 1.0-2.0 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 준비합니다.
3. 뉴런 세포 응집체의 형성
   1. 마이크로피펫을 사용하여 1.0-2.0 x 10⁶/mL 세포 현탁액 12μL를 PDMS 어레이의 각 마이크로웰(단계 2.1.7에서 플레이트에 배치됨)에 첨가합니다.
      참고: 세포 농도는 마이크로 컬럼 내경 및 원하는 세포 응집체 크기에 따라 조정될 수 있습니다. 농도가 높을수록 더 큰 응집체가 생성됩니다.
   2. 플레이트를 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 마이크로웰 바닥에 세포가 응집되도록 합니다(그림 2B). 응집된 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 각 PDMS 어레이의 상단에 ~2mL의 배양 배지를 조심스럽게 추가하여 시딩된 모든 마이크로웰을 덮습니다.
   3. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂에서 12-24시간 동안 배양합니다.

3. 마이크로 TENN

1. ECM 코어 제조의 세포 구성 요소 개발
   1. 응집체 배양 후, 마이크로 원심분리기 튜브의 배양 배지(각각 1mg/mL의 농도)에 유형 I 콜라겐과 라미닌을 첨가하여 ECM 용액을 준비합니다. 실온에서 3.1.2-3.1.4단계를 수행하되, 조기 겔화를 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 ECM이 있는 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.
      참고: 일반적인 비용은 각 마이크로 컬럼에 대해 4μL의 ECM 용액입니다(길이: 5mm, ID: 180μm).
   2. 초기 pH를 확인하기 위해 1-2 μL를 리트머스 종이에 옮기고 필요에 따라 1 μL의 1 N 수산화나트륨(NaOH) 및/또는 1 N 염산(HCl)을 ECM에 추가하고 pH가 7.2-7.4가 될 때까지 반복하여 ECM 용액의 pH를 조정합니다. 기포 형성을 방지하면서 위아래로 피펫팅하여 ECM 용액의 균질화를 보장합니다.
   3. 1.4.3단계의 접시에서 멸균된 집게가 있는 마이크로 컬럼을 35mm 또는 60mm 페트리 접시를 비우기 위해 옮깁니다. 탈수를 방지하기 위해 한 번에 4-5개의 마이크로 컬럼에서 작업하십시오. 10μL 팁을 1,000μL 팁에 마이크로피펫에 부착합니다. 시각적 안내를 위해 스테레오스코프를 사용하여 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 팁을 놓고 흡입하여 내강에서 잔류 DPBS와 기포를 추출합니다.
   4. 마이크로피펫에서 4-5μL의 ECM을 빠르게 추출합니다. 입체경으로 관찰하면서 마이크로피펫의 끝을 마이크로 컬럼의 끝 중 하나에 놓고 내강을 채울 만큼 충분한 ECM을 배출합니다. ECM을 통한 축삭 성장을 억제할 수 있으므로 내강에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포가 있는 경우 3.1.3단계에서 설명한 대로 ECM을 제거하고 ECM을 다시 추가합니다.
   5. 탈수를 방지하려면 각 마이크로 컬럼 주위에 ~2 μL의 ECM을 추가합니다. 페트리 접시에서 하이드로겔/ECM 마이크로 컬럼을 37°C 및 5% CO₂에서 25분 동안 배양합니다. 배양 직후 세포 파종을 진행합니다.
      참고: 3.1.5단계의 배양기는 마이크로 컬럼 내부에서 콜라겐과 라미닌이 중합되는 시간을 허용하기 위한 것입니다.
2. 마이크로 컬럼의 신경 세포 파종
   참고: 형질도입된 응집체의 배양 배지를 변경하려면 플레이트를 기울이고 마이크로피펫을 사용하여 웰 벽에 고인 배지를 제거한 다음 벽에 대해 ~1mL를 천천히 추가합니다(피라미드 형 마이크로웰의 응집체를 방해하지 않기 위해). 이 매체 변경을 두 번째로 반복합니다.
   1. 3.1.5단계의 배양 기간에 이어 약 10-20μL의 배양 배지를 마이크로 컬럼을 보유한 페트리 접시의 두 개의 자유 영역으로 옮깁니다. 마이크로피펫을 사용하여 응집체를 구조물이 들어 있는 페트리 접시로 개별적으로 옮기고 집게를 사용하여 배양 배지의 작은 풀 중 하나로 이동하여 세포 건강을 보존합니다.
   2. 입체경으로 관찰하는 동안 겸자를 사용하여 양방향 마이크로 TENN의 경우 마이크로 컬럼의 양쪽 끝에 응집체를 삽입하거나 단방향 아키텍처(원하는 대로)의 경우 한쪽 끝에 응집체를 삽입합니다. 스테레오스코프를 사용하여 마이크로 컬럼 내부의 응집체 배치를 확인합니다. 집게를 사용하여 시드된 마이크로 컬럼을 다른 작은 배양 배지 풀로 이동하여 탈수를 방지하고 골재 건강을 보존합니다.
   3. 응집체가 ECM에 부착되도록 37°C 및 5% CO₂에서 45분 동안 배양합니다. 스테레오스코프를 사용하여 응집체가 마이크로 컬럼의 끝에 남아 있는지 확인합니다. 세포 응집체를 다시 도입하고 필요에 따라 배양 단계를 반복합니다.
   4. 혈청학적 피펫을 사용하여 마이크로-TENN이 포함된 페트리 접시에 배양 배지(35mm 또는 60mm 페트리 접시의 경우 각각 3mL 또는 6mL)를 조심스럽게 범람시킵니다. 장기 배양을 위해 접시를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터에 넣습니다.
   5. 배양 배지를 사용하여 2일마다 하프 배지 교체를 수행합니다. 피펫으로 오래된 배지의 절반을 조심스럽게 제거하고 마이크로 TENN이 흡입되지 않도록 시각적 안내를 위해 입체경을 사용합니다. 피펫으로 미리 예열된 신선하고 예열된 배지를 천천히 추가하는 것으로 교체하십시오.

결과

그림 1: 세포 응집을 위한 레이저 절단 마이크로 컬럼 제조 장치 및 3D 프린팅 피라미드 형 마이크로웰 몰드의 청사진. (A)-(B) 하이드로겔 마이크로 컬럼을 제작하는 데 각각 사용되는 원통형 채널 어레이의 하단 및 상단 절반의 청사진 및 이미지. (C) 장치를 함께 고정하는 데 사용되는 캡의 청사진 및 이미지. 앞쪽과 뒤쪽 조각은 모두 동일한 치수를 공유합니다. (D) 마이크로 컬럼을 제작하는 데 필요한 조립된 장치의 이미지. 두 개의 캡과 아래쪽...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
레이저 절단기	범용 레이저 시스템	PLS4.75	레이저 절단 마이크로 채널 금형을 제작하는 데 사용됩니다.
레이저 절단 마이크로 컬럼 제작 장치	맞춤형	--------------	관심이 있으시면 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수 및 청사진.
나사	--------------	--------------	40-3.05mm 나사 직경 3.05mm
너트	--------------	--------------	#4-40 침
술 바늘(직경 180μm)	Lhasa medical	sj.16X40	은 마이크로 컬럼 루멘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
페트리 접시	피셔	08772B
덜베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	Invitrogen	14200075
폴리스티렌 일회용 혈청학적 피펫	피셔	13-678-11D
아가로스	시그마	A9539-50G
모세관(직경 398μm)	피셔	21170D	직경은 마이크로 컬럼 쉘의 원하는 크기에 따라 변경될 수 있습니다.
핫 플레이트	피셔	SP88857200
마그네틱 바	피셔	1451352
마이크로피펫	시그마	Z683884-1EA
25mm 게이지 바늘	피셔	14-826-49
마이크로메스	Roboz 외과	RS-6270
가위	과학 도구	14081-09
집게	세계 정밀 기기	501985
핫 비드 멸균기	시그마	Z378550-1EA
입체경	니콘	SMZ800N	모든 해부 단계 및 마이크로 TENN 제조에 사용됩니다.
쥐 꼬리 I 타입 콜라겐	코닝	354236	4ºC로 유지하고 필요할 때만 제거하십시오. 사용 시 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
마우스 라미닌	Corning	354232	4ºC로 유지하고 필요할 때만 제거하십시오. 사용 시 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
신경기저 배지	Invitrogen	21103049	태아 및 배아 신경 세포 배양을 위한 기저 배지. 사용 전 4ºC에서 보관하고 37ºC에서 따뜻하게 보관하십시오.
수산화나트륨(NaOH)	피셔	SS2661
염산(HCl)	피셔	SA48-1
리트머스 종이	피셔	09-876-18
행크의 균형 소금 용액(HBSS)	Invitrogen	14170112	4ºC에서 보관하십시오.
0.25% 트립신-EDTA	Invitrogen	25200056	사용하기 전에 -20ºC에서 보관하고 37ºC에서 따뜻하게 보관하십시오.
소 췌장 데옥시리보뉴클레아제(DNase) I	시그마	10104159001	사용하기 전에 -20ºC에서 보관하고 37ºC에서 따뜻하게 보관하십시오.
B-27 보충제	Invitrogen	12587010	해마 및 피질 뉴런 배양을 위해 신경기저 배지에 첨가된 보충제입니다. -20ºC에서 보관하고 사용 전 37ºC에서 따뜻하게 보관하십시오.
L-글루타민	Invitrogen	35050061	사용하기 전에 -20ºC에서 보관하고 37ºC에서 따뜻하게 보관하십시오.
Sprague Dawley 배아 18 일 쥐	Charles River	Strain 001
파스퇴르 피	피셔	22-042816
15mL 원심 분리기 튜브	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
원심 분리기	Fisher	05-413-115
혈구계	Fisher	02-671-6
Objet30 3D 프린터	Stratasys	--------------	피라미드형 마이크로웰 금형을 제작하는 데 사용됩니다.
3D 프린팅 피라미드 우물 금형	맞춤 제작	--------------	관심이 있으시면 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수 및 청사진.
폴리디메틸실록산(PDMS) 및 경화제	피셔	NC9285739	엘라스토머와 경화제가 포함된 키트로 제공됩니다. 화학 연기 후드 내부에서 사용하십시오.
깔때기	피셔	10-348C
1ml 피펫 전구	시그마	Z509035
마이크로 주걱	피셔	S50821
12웰 배양 플레이트	EMESCO	1194-353043
오븐	피셔	11-475-154
인큐베이터	피셔	13 998 076
Eclipse Ti-S 현미경	Nikon	--------------	위상차 이미지를 촬영하는 데 사용됩니다. Nikon elements 기초 연구 소프트웨어(4.10.01)와 인터페이스된 QiClick 카메라를 사용하여 디지털 이미지 획득.

#의 직경 정밀 , 펫