무한 호라이즌 임팩터을 사용하여 일방적 경부 척수의 부상의 Contusive 모델

요약

무한 호라이즌 임팩터를 사용하여 자궁 경부 일방적 척수 부상을 생산하기위한 안정적이고 반복 가능한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 사용자 정의 설계된 프레임을 활용하고 척추를 고정 클램프. 표준화된 절차와 충분하고 지속적인 부상의 biomechanical 부상 매개 변수 결과.

초록

인간의 척수 부상의 대부분이 경추 척수에서 발생하는 반면, 실험실 연구의 대부분은 흉부 척수 부상되는 척수 손상 (SCI)의 동물 모델을 고용합니다. 대부분의 인간 코드 부상은 척수가 심하게 전이 뼈 혹은 부드러운 티슈에 의해 명중되고 무딘 아닌 관통 외상 (예, 자동차 사고, 스포츠 부상)의 결과로 발생할 수 있기 때문에 또한, SCI 연구원의 대부분이 견해입니다 가장 임상적으로 관련성이 부상 모델 척수가 급속하게 contused되는 사람임을. ¹ 따라서, 인간의 번역에 대한 그들의 방식에 관한 소설 치료의 잠복기 평가에서 중요한 단계는 이내 타박상 SCI의 모델에서의 효능 평가입니다 경추 척수. 직원을 고용 여기, 우리는 기술적인 측면과 자궁 SCI의 일방적 contusive 모델의 결과 해부 학적 및 행동 결과를 설명하는 그무한 호라이즌 척수 손상의 임팩터.

Sprague Dawley에 쥐가 C5에서 왼쪽으로 양면 일방적 laminectomy을 받았습니다. 부상 모델, biomechanical 기능 및 histological 결과의 재현성을 최적화하기 위해, 우리는 150 kdyn의 충격 힘, 22.5 ° (동물이 22.5 °로 회전)의 영향 궤도를 사용하여 척추 코드를 contused 및 충격 위치 오프 1.4 mm의 중간선니다. 기능 회복이 최대 6 주 동안 테스트 및 수정된 몬토야의 계단 테스트를 정리, 실린더 양육 검사, 수평 사다리 테스트를 사용하여 평가되었다, 그 후 척수 코드는 흰색과 회색 물질 살려주는 histologically 평가했다.

여기에 제시된 부상 모델은 척수, 모든 실험 SCI 모델의 중요한 특징으로 일관하고 재현할 biomechanical 세력을 부여. 척수의 측면 절반 이산 histological 손상의이 결과는 크게 t에 포함되는부상 그는 ipsilateral 측면. 부상이 잘 동물들에게 용납하지만, 중요하고 부상에 따라 주 동안 지속있는 forelimb의 기능적 결손의 결과를하지 않습니다. 여기서 제시 자궁 일방적 부상 모델은 인간의 번역 이전 잠재적으로 유망한 치료법을 평가하고자하는 연구자에게 자원이있을 수 있습니다.

프로토콜

1. 동물을 보관하는 프레임 및 클램프 디자인 : 설정

1. 동물을 잡아 프레임과 클램프는 무한한 지평선 (IH) 척수의 상해 임팩터을 수용하기 위해 맞춤 설계되었다.
2. 프레임의 기본은 다음 크기 (30.2 cm X 20.3 cm X 1.3 ㎝) IH 장치 (그림 1A)과 기본으로 제공 테이블 가이드 브래킷에 맞춰 순서로 자른 알루미늄 플랫폼입니다.
3. 네 Flexaframe 지원 발 플레이트는 (ON 피셔 과학, 토론토,) 플랫폼 및 8 Flexaframe 지원 봉 (ON 피셔 과학, 토론토, 30.5 ㎝) 팔 Flexaframe 지원 커넥터 (그림 1B)를 사용하여 조립하고 붙어있다.
4. 중앙이 막대에 연결된 두 개의 추가 Flexaframe 지원 커넥터, 집에서 만든 습관 클램프 (그림 1B)를 보유하고 있습니다.
5. 동물의 척수가 수직와 관련해서 회전하는 각도는 키울에 의해 설립되어g 장소에 수평 막대 중 하나와 다른 수평 막대 (그림 2)의 높이를 변화.
6. 클램프 길이 35.6 mm, 높이 25.4 mm 및 rigidly C4에서 C6 (그림 1C)에 가로 프로세스 아래를 꽉 잡아하도록 설계된 7.6 밀리미터 턱에있는 것입니다. 클램프 설계에 대한 추가 세부 사항은 츄 외 의해 이전에 설명되었습니다., 2009.

2. 외과

1. 3백-3백50g 무게 남 Sprague Dawley 쥐 (찰스 리버 연구소)은 산소 (1 L / 분)에서 (유도 4 % 및 유지 보수 2 %) isoflurane에 의해 anesthetized 있었다.
2. 동물 마취의 비행기하에되면, 동물들은 stereotaxic 프레임 (Kopf, Tujunga, CA)에 위치합니다.
3. lidocaine의 수술 0.4 ML (20 밀리그램 / ML, Bimeda - MTC 동물 건강 주식 회사, 캠브리지, 온타리오, 캐나다) 동안 출혈을 최소화하기 위해 에피네프린있는 것은 dorsa의 수술 현장 주변 intramuscularly 주입된다난 목이 영역.
4. 4~5센티미터 지느러미 중간선 절개는 두개골의 기초부터 시작하고 caudally 확대 무균 메스를 (# 15)를 사용하여 이루어집니다.
5. 멸균 Adson의 포셉은 퉁명스럽게 척추 및 멸균 ALM 리트 렉터 (파인 과학 도구, 노스 밴쿠버, BC) 근육이 떨어져 확산 유지 삽입에 도달 지느러미 근육을 통해 해부하는 데 사용됩니다.
6. # 15 메스, 사용 C4-C7의 laminae를 오버레이 근육은 중간선에서 시작하고 laterally 그들을 청소하고, 긁어 냈있다.
7. 멸균 메스 (# 15)와 절개가 C6에 C4의 가로 프로세스 아래 클램프에 맞게 척추의 두 측면에 가로 프로세스에 연결된 근육으로 이루어집니다.
8. 멸균 벌금은 프리드먼 - 피어슨 Rongeur을 (파인 과학 도구, 노스 밴쿠버, BC) 끌어내려으로 왼쪽 C5 얇은 판은 신중하게 경질하고 척수를 시각화하기 위해 제거됩니다.
9. 1.5 mm의 직경이 막대는 팔 밑에 하락하고 있습니다따라서 약간 척추를 제기하고 클램프 삽입을 촉진, 동물을 세우다합니다.
10. C6에 C4의 측면 가로 프로세스 진입 멸균 클램프의 턱뼈를 탑재하고 나사를 조입니다.
11. ALM 리트 렉터를 제거합니다.

3. 척수의 상해

1. 클램프가 동물에 장착되면 동물은 IH의 임팩터으로 이동됩니다.
2. 클램프는 수평의 해제 22.5 °의 각도 (그림 2)에서 확보되어 프레임의 두 가지 가운데 막대에 금속 홀더에 삽입됩니다.
3. 동물이 평평 들이죠 때까지 안정적인 높이 조정 (VWR, Mississauga, ON)을 제공 가위 잭까지 증가합니다.
4. 클램프 클램프 위에 작은 실린더 수준을 배치하여하고 나사를 강화하여 수평인지 확인하십시오. 그것은 모든 나사가 꽉이며 세트가 아무 움직임도없는 딱딱한 것이 중요합니다.
5. 절차의 나머지 micr 아래 실시됩니다oscope (Leica MZ8).
6. 내리고 임팩터 팁의 중심 C6 spinous 과정의 꼭대기 위에 서성 거 리고 때까지 IH의 임팩터에 수직 조절 노브 두 개의 수평 조절 단자를 사용하여 임팩터 팁 (둥근 오프 가장자리와 직경 15 밀리) 목표로합니다.
7. 임팩터 팁이 중심되면 Y 축 조정 노브 하나 C5의 중심에 임팩터 팁을 이동 왼쪽과 X 축 수평 조절 노브로 laterally 제보를 이동하는 방법은 두 다섯째 차례 (1.4 mm)를 켜십시오.
8. 그것이 임팩터 팁은 회색 물질의 측면 절반을 목표로되었는지 확인하기 위해 단지 경질 위에 때까지 팁을 낮춥니다.
9. 두 경질 위의 팁을 4mm를 높이 망칠 수직 조절 노브를 돌립니다.
10. 영향을 미치는 영역은 면봉이나 스틱을 사용하여 건조한지 확인하십시오.
11. 프로그램에 대한 150 kdyn에 원하는 력을 설정하고 임팩터를 실행하려면 "시작 실험"을 클릭하십시오.
12. 부상 후 상처가 laye에 닫혀있다5-0 vicryl로 봉합 RS. Buprenorphine (0.03 밀리그램 / kg SC, Temgesic, Schering-북두칠성 공사 케닐워스, 뉴저지)과 염분은 (10 ML) 전에 subcutaneously 시행하고 수술 후 이틀 동안 두 번 매일하고 있습니다. 동물 밀접하게 이주 및 육주 포스트 부상 한 일주일 동안 하루에 두 번 감시하고 있습니다.

4. 대표 결과

3백-3백50g 무게 스물 아홉 수컷 Sprague Dawley 쥐 (찰스 리버 연구소가) 150 kdyn의 강제 설정에서 부상을 당했다. 임팩터 팁은 세로 22.5 ° 오프의 각도로, 중간선까지 가로 1.4 mm를 목표로했다. 평균 실제 병력은 155.55이었다 ± 0.73 kdyn. 평균 변위는 1512.72이었다 ± 27.86 μm의 및 속도는 120.24이었다 ± 0.52 mm / s의 (그림 3).

행동 결과 대책

기능 회복은 테스트를 정리, 수평 사다리 테스트, 실린더 양육 테스트를 사용하여 평가되었다와 몬토야 계단 시험 ¹ 수정했습니다. 동물은 부상 전 훈련과 2, 4 및 6주 이후 부상에서 평가되었다. 실험 기간에 걸쳐 지속 상당한 forelimb에 장애가 발생했습니다.

수평 사다리 시험. 부상하기 전에, 동물은 4.75 ± 0.73 % 만들어 오류를 ipsilateral forelimb에 부정기 간격 수평 사다리에 걸쳐 선법 동안. 부상에 따라 동물 forelimb 오류의 비율에 표시된 증가를 보여주었다. ipsilateral forelimb %의 오류가있었습니다 26.97 ± 2.92 %, 26.23 ± 2.84 %와 22.06 ± 2.05 % 2, 포스트 부상 4와 6 주, 각각 (그림 4A). 중요한 것은,이 시험에 forelimb 장애는 6 주 동안 지속되었다.

실린더 양육 시험. ipsilateral forelimb의 비율 (왼쪽 + 모두) 탐험 중에 사용은 SCI 후 현저히 감소.부상 이전 동물 ipsilateral forelimb 75.12 ± 2.25 %를 사용했습니다. 다친 후에 동물 ipsilateral forelimb 8.59 ± 2 주된 1.80 %, 14.25 ± 2.65 % 4 주된 및 11.76 ± 6주 (그림 4B)에서 2.66 %를 사용했습니다.

몬토야 계단 테스트를 수정했습니다. ipsilateral forelimb로 검색된 알약의 숫자는 부상 후 극적으로 감소. 부상 이전 동물 84.85 수집 ± 식품 보상의 2.88 %를. 그러나, 2, 4, 6주 이후 부상에서 동물은 30.91을 검색한 ± 4.03 %, 28.94 ± 4.38 %와 25.86 ± 쥐똥 (그림 4C)의 3.09 %를.

테스트를 정리. 부상 후 정리 악보에있는 극적인 감소가있었습니다. 2.00 ± 0.17 4 주 : 1.83 ± 0.17과 6주 : 1.79 ± 0.11 (Figu SCI 후 ipsilateral 정리 점수는 2 주 남겨두고 있었고다시 4D).

Histological 결과

흰색 물질과 회색 물질이란 조금. 150 kdyn의 힘, 22.5 °와 1.4 mm의 측면 목표의 각도에서 척수 손상의 예제는 그림 5에 표시됩니다. 부상은 ipsilateral 측면에 회색과 흰색 문제에 상당한 손상을 초래. corticospinal 및 rubrospinal의 책자 모두 부상 29 동물의 아웃 23 ipsilateral 측면에 포함된 parenchymal 손상을 가지고 있었다. 흰색과 회색 물질 피해의 세로 범위는 rostrally 2400 및 caudally 2,400 (그림 6)였다. 흰색과 회색 물질이란 조금의 "누적 확산"(2000 μm의 주동이의과 진원에 꼬리)의 총 추정을 제공하는 섹션을 추가할 때 ipsilateral 측면에서만 구했다고 하얀 물질이 51.8 %, 회색 물질의 39.7 %를 가지고 남은 contralateral 사이드 (그림 6)에 비교했다.

1 그림. 무한 호라이즌 척수 손상의 임팩터. A. 전체적인 무한 호라이즌 임팩터하고 설정합니다. B. 프레임 설정합니다. 자궁 가로 공정을 쥐고 클램프의 C. 클로즈업 이미지입니다. 클램프의 : D. 규격 (인치 단위). 에서 제안된 관용 <0.002 (츄 외. 2009). 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 2. A. 일러스트 레이션 및 해당 프레임은 0 ° (중성) 또는 B. 22.5의 척수 회전을 달성하기 ° 1.4 mm의 측면 목적으로 설정합니다.

그림 3. 무한 호라이즌 임팩터위한 대표 힘 및 변위 그래프. 화살 I임팩터 팁 20 kdyn과 변위의 녹음이 시작되는 지점에 도달하는 시간을 ndicates. 실제 무력은 힘 대 시간 곡선의 피크에서 읽고되고 해당 변위가 계산됩니다. 아래 그래프는 전형적인 150 kdyn 타박상을 묘사, 답변 배기량 대 시간 그래프, B. 힘 대 시간 그래프. 이러한 그래프 달성 실제 힘은 코드가 1287 μm의 것으로 측정되었다에 152 kdyn 및 임팩터 변위 것을 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

4 그림. 150 kdyn의 힘, 1.4 mm의 22.5 ° 및 목표의 임팩터의 angulation을위한 행동 평가는 중간선. A. 왼쪽 수평 사다리 시험. B. 실린더 양육 시험. C. 수정일 몬토야 계단 시험. 디 시험 정리. ipsilateral forelimb는 결과 중요하고 sustai네드 장애는 contralateral forelimb에 비해.

그림 5. 꼬리 1,600 μm의에 주동이의 1600 μm의에서 부상 척수의 대표 이미지.

6 그림. Histological 평가. A. 비율 흰색과 회색 물질을 보존할. 2000 주위에 피해 진원의 μm의가 크게 아끼지되었습니다 상관. 손상의 진원지 2000 μm의 안에서 겪었던 B. 누적 흰색과 회색 물질. ipsilateral 측면이 훨씬 적은 contralateral 측면에 비해 흰색과 회색 물질을 살려주었다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

토론

본 논문에서 우리는 150 kdyn, 수직의 오프 22.5 °의 각도, 그리고 중간선에서 1.4 mm의 측면 목표의 힘에 무한한 지평선 (IH) 임팩터를 사용하여 자궁 경부 일방적 타박상 모델을 설명합니다. 이러한 설정을 통해, 우리는 그것 상당한 피해 rubrospinal, reticulospinal, vestibulospinal 및 corticospinal 책자가에 예상되어지는 지역에 발생한 나타나 크게 ipsilateral 옆으로 포함된 parenchymal 중단과 ipsilateral forelimb의 지속 행동적 결손을 만들 수있었습니다 실행합니다. 이 모델의 개발은 최적의 부상 력, 중간선의 오프 충격 위치 및 회전 정도를 설립 세 일련의 실험에서 발생했습니다. 첫째, 우리는 150 kdyn 아래의 부상 세력이 충분하고 지속적인 기능적 결손을 생산하지 않은 것으로 나타났습니다. 또한 코드 수직을 (아무 회전 IE) 삼진 임팩터 팁과 함께, 우리는 자주 F에 스파이크를 관찰부대 대 시간 곡선, 임팩터 팁은 척추 운하의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비의 명칭	회사	카탈로그 번호	댓글
무한 호라이즌 임팩터	정밀 시스템 및 계측	IH-0400
알루미늄 메탈 시트	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe 지원 발 플레이트	어부 과학	1466625Q
Flexaframe 지원 막대	어부 과학	1466610GQ
Flexaframe 지원 커넥터	어부 과학	1466620Q
1 고정	사용자가 만든		츄 외.2009 년
금속 보유자	사용자가 만든		위 참조
임팩터 팁	사용자가 만든		직경 : 1.15 mm
Stereotaxic 프레임	데이비드 Kopf 인 스트 루먼트	모델 900
실린더 수준	YIJIA TOOLS	YJ-SL0620
현미경	Leica		모델 # : MZ8
실험실 가위 잭	VWR	12620-902