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방법 논문

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO 학습

15.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3316

⸱

2011년 8월 23일

 ,  , 
1Department of Agricultural and Biological Engineering, Mississippi State University

이 논문에서

요약

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

좌심실과 대동맥 사이에 대동맥 밸브, 뇌실에 역류 방지, 단방향 혈액의 흐름을 허용합니다. 대동맥 밸브 전단지는 세포외 매트릭스 (ECM) 내에 정지 및 내피 세포 monolayer로 채워져 있습니다 침입형 세포로 구성되어 있습니다. 밸브는 거칠고, 역동적인 환경을 withstands하고 지속적으로 전단, 굴곡, 인장 및 압축에 노출됩니다. 연구 내피 중단하거나 중간 매트릭스 손상 1-3의 결과로 높은 기계적 응력 영역에서 발생하는 질병 밸브에 calcific 병변을 보이지 않고있다. 따라서, 그것은 역학 연구 대동맥 밸브 질환 4 발병의 주요 위험 요인으로 고혈압을 보여준 것은 놀라운 일이 아니다.

밸브 질환에 대해 현재 사용할 수있는 유일한 치료 방법은 bioprosthetic 또는 기계적 밸브 5 낡고 밸브의 수술 대신합니다. 물리적 스트레스에 대한 응답으로 밸브 생물학의 개선 이해 밸브 pathogenesis의 메커니즘을 명료하게하다 도움이 될 것이다. 차례로,이 같은 제약 개입이나 방지와 같은 비침습 요법의 개발에 도움을 줄 수 있습니다. 여러 bioreactors는 이전에 다음 ID로 기본 설계 또는 심장 밸브 6-9의 mechanobiology을 연구하기 위해 개발되었습니다. 타악기 bioreactors 또한 연골 10 골 11 방광을 포함하여 12 조직의 범위를 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 작품의 목적은 증가 압력 하중에 대동맥 밸브 전단지의 생물 학적 반응을 명료하게하다하는 데 사용할 수있는 순환 압력 시스템을 개발하는 것이었습니다.

이 시스템은 샘플을 장소와 순환 압력, 압력 사이클의 타이밍을 제어하는​​ viton의 격막 솔레노이드 밸브, 전기 장치를 제어하는​​ 컴퓨터를 생산하는 아크릴 챔버로 구성되어. 압력은 압력 변환기를 사용하여 모니터링할 있었고, 신호는 부하 셀 컨디셔너를 사용하는 시설되었다. LabVIEW 프로그램은 적절한 속도로 시스템에 압축 공기를 펌프하는 아날로그 장치를 사용하여 압력을 규제. 시스템은 대동맥 밸브와 연결된 동적 transvalvular 압력 수준을 했었, 소우 치아 파의 밸브 개방을 묘사한 날카로운 압력 강하 다음 음절 연장 기간 동안 밸브에 걸쳐 존재하는 transvalvular 압력 구배의 전형적인 압력의 점진적 증가, 생산 수축기. LabVIEW 프로그램은 사용자가 주기적 압력의 크기와 주파수를 제어할 수있었습니다. 시스템은 생리와 병리 학적 압력 조건에 조직 샘플을 대상 수있었습니다. 이 장치는 심장 밸브가 로컬 기계 환경의 변화에​​ 대응하는 우리의 이해를 높이기 위해 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 조직 하베스트 및 준비

  1. 대동맥 밸브는 바로 죽은 후 더 이상 120 이상 파운드 무게 성인 돼지에서 수집해야합니다.
  2. 멸균 인산과 함께 두 번 밸브를 세척 식염수 (PBS)와 얼음에 실험실로 전송이 버퍼.
  3. 모든 후속 단계는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
  4. 그 전단지가 찢어이나 석회화, 변성의 기호를 표시하지 않도록. 환대에서 거리의 1 / 3 절단하여 대동맥 루트에서 전단지를 제거합니다.
  5. 플레이스 여섯 잘 접시의 각각의 우물에서 전단지 37 ° C와 5 % CO 2에서 1퍼센트 anti-biotic/anti-mycotic 솔루션와 10 % 태아 소 혈청과 보충 3ml Dulbecco의 수정된 이글 매체와 함께 밤새 품어.
  6. 대체 절연 세포 6 - 잘 문화 접시에 씨앗을 품고 및 압력 장치에 사용될 수 있듯이. 이전 13 14 설명된대로 밸브 내피 세포와 중간 세포의 분리는 수행할 수 있습니다.

2. 압력 연구

  1. 맞춤 만든 압력 시스템은 대동맥 밸브 조직 15 순환 압력 mechanobiological 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다.
  2. 컴퓨터에 로그인하고 labVIEW 프로그램 (그림 1)을 엽니다.
  3. 보정 :
    1. 이전 실험하기 위해 시스템이 적절히 보정해야합니다.
    2. 회로 기판에 전원 공급 장치를 연결합니다. 이것은 챔버로 밖의 공기의 흐름을 제어 솔레노이드 밸브에 전원을 제공합니다.
    3. 압축 공기가 시스템에 연결되어 있는지 확인하고 전체 속도로 공기 공급 장치를 엽니다.
    4. 신호 증폭기를 켭니다. 전압 독서가 0.00 있는지 확인하십시오. 필요에 따라 조정
    5. labVIEW 인터페이스는 "TEST / 기록"라고 표시된 스위치가 있습니다. 스위치가 "TEST"로 설정되어 있는지 확인하십시오. "공기 공급"유입 솔레노이드 밸브를 열고 표시된 버튼을 클릭합니다.
    6. 가스 압력 조절기를 사용하여, 1 PSI에 압축 공기 챔버의 기압. 챔버의 압력 챔버의 최종 플레이트 후면에있는 디지털 압력 게이지를 사용하여 읽을 수 있습니다. 압력 equilibrated되면, 신호 증폭기에서 전압 독서를 기록합니다. 2, 3, 4 및 5 PSI에 대해 반복합니다.
    7. 압력 대 전압의 보정 곡선을 구축. 압력은 PSI에서 mmHg로 변환해야합니다. 그래프의 방정식은 labVIEW 프로그램의 코드에 삽입할 수 있습니다
  4. 압력 챔버에서 알루미늄 전면 플레이트를 제거하고 70 % 에탄올로 챔버를 스프레이. 잔여 에탄올 가스가 분산 수 있도록 10 분 최소 둡니다.
  5. 챔버에 전단지 샘플을 포함하고있는 여섯 잘 플레이트를 삽입하고 프런트 엔드 플레이트를 교체하십시오. 봉인 손으로 네 개의 스레드 막대 (경판의 각 모서리에 위치)에있는 너트를 강화하여 밀폐 있는지 확인하십시오. 37 ° C 배양기에서 압력 챔버를 놓습니다. 압력 챔버의 구조 다이어그램은 그림 2에 표시됩니다.
  6. 인터페이스는 압축 공기 입력 및 출력 사이의 시스템의 순환 시간을 제공하기 위해 사용자에게 프롬프트합니다. 이러한 1Hz의 주파수에서 각각 0.6s와 모방에 0.4s diastolic과 수축기 조건에 설정해야합니다. 사용자는 또한 데이터 파일의 경로를 입력합니다.
  7. labVIEW, 실행을 클릭하고 "레코드"로 "TEST / 레코드가"토글 스위치.
  8. 압력이 labVIEW 인터페이스에 대한 그래프를 사용하여 원하는 수준에 있는지 확인하십시오. 압력은 가스 압력 조절기를 사용하여 조정할 수 있습니다.
  9. 시간의 원하는 기간 동안 프로그램을 실행합니다.
  10. 실험이 완료되면, labVIEW에있는 중지 버튼을 클릭 공기 공급 장치를 끄고 압력 챔버에 배기 밸브를 엽니다.
  11. 챔버에서 프런트 엔드 플레이트를 제거하고 여섯 잘 플레이트가 포함된 샘플을 검색할 수 있습니다. 샘플은 현재 유전자 발현, 단백질 표현, 조직학, 기계적 성질 등의 분석 수

3. 대표 결과 :

압력 시스템은 normotensive 하에서 관찰 최대 transvalvular 압력을 시뮬레이션 할 수있어, 내가 무대 II 신경성 조건을 무대. 단, 압력은 생체내에 본질적으로 제로입니다 수축기 압력 기울기를 모방 수 없습니다. 주파수는 0.6s 0.4s의과 배기 시간의 공기 유입 시간, 1Hz에서 관리하고 있습니다. 시스템에서 얻은 정상 및 높은 압력 조건의 대표 압력 파형은 그림 3에서 볼 수 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1 : LabVIEW 인터페이스의 스크린 샷.

figure-protocol-2
그림 2 : 압력 챔버의 압력 챔버 A. 사시의 도식 그림, 압력 챔버의 B. 사이드보기;압력 챔버의 C. 톱 볼 수 있습니다.

figure-protocol-3
그림 3 : (A) normotensive, (B) 나는 신경성 스테이지, 그리고 (C) 스테이지 II 신경성 조건에서 압력 챔버 내의 압력 시뮬레이션의 그래프.

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토론

압력 시스템은 성공적으로 diastolic transvalvular 압력을 대표했다 순환 압력에 대동맥 밸브 전단지를 노출. 압력은 40 mmHg로 감소 그러나, 그것은 수축기 transvalvular 압력을 모방 수 없습니다. Transvalvular 압력은 오름차순 대동맥의 압력과 좌심실 사이의 차이입니다. 심장 확장하는 동안, 밸브가 닫힐 때, 압력 차이가 normotensive 조건 90 mmHg 이하 80mmHg이며 무대 II의 고혈압은 각각 단계 100mmHg. 수축기 동안, 밸브가 열려있을 때, 좌심실과 대동맥 사이에 상승 압력 차이가 제로입니다. 대동맥 밸브 질환에서 발생하는 세포 변화가 높은 diastolic 압력과 연관된 것으로 않으므로 압력이 제로로 떨어진 게 아니라는 사실은 큰 우려되지 않을 수 있습니다. 이것은 그것이 압력 크기 및 생물 학적 반응의 원동력되지 압력 진폭이라는 가정을 기반으로합니다. 100 mmHg에서 0 mmHg로 압력을 감소시 20 압력 사이클의 데이터 분석에서 보고된 1.20 ± 0...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 원고를 준비하여 시스템 및 지원 Valtresa의 마일즈의 설계 및 제조와 그들의 도움을 쉐그 Schipke, 다니엘 체서에게 감사하고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 (옵션)
DMEM 시그마 D5671
Dulbecco의 PBS 시그마 D5652
Anti-mycotic/antibiotic 솔루션 시그마 A5955
태아 소 혈청 ThermoScientific SH30070
Viton의 격막 솔레노이드 밸브 맥매스터 카 4868K11
압력 변환기 오메가 엔지니어링 주식 회사 PX302 - 200GV
로드 셀 컨디셔너 앙코르 전자 주식 회사 4025-101
데이터 수집 (DAQ) 모듈 측정 컴퓨팅 PMD1608

참고문헌

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