Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Hildegonda P.H. Naber; Eliza Wiercinska; Peter ten Dijke; Theo van Laar

doi:10.3791/3337

Summary

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

Abstract

TGF - β는 초기 단계에서 종양 억제 역할을하지만, 나중에 무대 ^1,2에서 침략과 전이를 자극하여 유방암의 진행에서 역할을 반대했다. 또한, TGF - β가 자주 유방암에 overexpressed과 그 표현이 불쌍한 예후와 전이 ^3,4와 상호입니다. TGF - β 유도의 공격을 잘 이해하지하는 메커니즘.

TGF - β는 TGF - β 타입 II (TβRII)와 유형 I (TβRI) 수용체를 통해 세포의 반응을 elicits. TGF - β - 유발 heteromeric 복잡한 형성되면, TβRII는 TβRI을 phosphorylates. 활성 TβRI는 phosphorylating 수용체 Smads (R - Smads), 즉 Smad2 및 Smad3하여 세포내 표준 신호 경로를 시작합니다. 이러한 활성 R - Smads는 핵에 축적하고 목표 유전자 ⁵ 전사를 조절 Smad4와 heteromeric 단지를 형성하고 있습니다. 이전에 D 이외에escribed Smad 경로, 여러 비 Smad 신호 경로의 활성화에 수용체 활성화 결과가 예를 들어 Mitogen는 단백질 키나제를 활성화하면 (MAPK) 경로 ^6.

유방암의 여러 단계에서 TGF - β의 역할을 연구하기 위해, 우리는 MCF10A 전지 시스템을 사용했다. 이 시스템은 자발적으로 남을 MCF10A1 (M1) 유방 상피 세포를 ^7로 구성되어, H - RAS는 생쥐 ⁸ premalignant 병변을 생산 M1 - 파생 MCF10AneoT (M2), 그리고에서 설립되었습니다 M2 - 파생 MCF10CA1a (M4)를 변형 M2 xenografts 및 양식 폐 ⁹ 전이하는 능력을 가지고 고급 carcinomas. 이 MCF10A 시리즈는 다른 유전 배경에 의해 편견없는 강한 악의의 다른 성적 세포의 반응을 연구하기위한 가능성을 제공합니다.

TGF - β - 유발 침략의 분석을 위해, 우리는 homotypic MCF10A 회전 타원체 셀 문화 embe를 생성시험 관내 (그림 1)에서 3D 콜라겐 매트릭스에 dded. 이러한 모델은 밀접하게 회전 타원체 ¹⁰ 내부에 괴사성도 외부와 정지 또는 세포에 대한 활성화 및 침입 세포의 결과로, 산소와 영양소의 그라데이션을 확립하여 생체내 인간의 종양과 유사. 회전 타원체 기반 assays는 monolayer 문화 ¹¹ 이상의 약물 저항을 잘 요점을 되풀이하는 표시되었습니다. 이 MCF10 3D 모델 시스템은 우리가 강한 악의의 다른 단계에서 유방암 세포의 침투 특성에 TGF - β 신호의 영향을 조사 수있었습니다.

Protocol

1. methocel 솔루션의 준비 (500 ML)

자기 활동가를 포함한 500 ML 병에 메틸 셀룰로오스의 압력솥 6g.
20 분에 대한 혈청 (60 ° C)없이 preheated DMEM/F12 250 ML에 메틸 셀룰로오스를 분해.
10 % 말 혈청을 포함하는 DMEM/F12 (RT) 250 ML을 추가합니다. 믹스 하룻밤 (4 ° C).
원심 분리 (5천그램, 2 시간, 4 ° C)의 솔루션을 취소합니다.
새로운 튜브 (재고 솔루션의 90-95 % 정도)에 명확한 높은 점성 솔루션을 가져가라.
4 저장 ° C까지 사용.

2. 회전 타원체 문화

20 % methocel 솔루션 (10 ML methocel 40 ML 성장 매체) 준비.
PBS로 두 번 세포를 씻어, 37에서 0.1 %의 트립신과 부화 세포를 추가 ° C
성장 매체 세포를 Resuspend하고 세포를 계산합니다.
20 % methocel에서 ML 당 10 000 세포 현탁액을 준비합니다.
96 잘 둥근 바닥의에 세포 현탁액을 추가uspension 플레이트 (물론 당 100 μl).
다음날, 서스펜션 플레이트의 회전 타원체 형성을 확인합니다. Spheroids 1-3 일 후에 사용할 준비가됩니다.

3. 콜라겐의 준비

얼음 8 ML의 콜라겐, 1 ML 10X PBS, 1 ML 0.1 N NaOH 3 방울 0.1 N HCL의 솔루션을 준비합니다. 산도가 산도 표시기 스트립에있는 솔루션의 일부를 야생으로 7.4 있는지 확인하십시오. 인지 범위의 산도를 조정합니다.
96 잘 접시의 우물에 무력화 콜라겐 솔루션 50 μl 추가
37 품어 ° C 콜라겐이 (90 분) 확정되기 전까지.
얼음 methocel - 콜라겐 - 리간드 솔루션을 준비 : 콜라겐 솔루션의 각 리간드 피펫 한 부분. 콜라겐 TGF - β의 20 NG 당 ML을 추가합니다. 다른 레이어 위에 methocel 및 확산과 희석 후 TGF - β의 최종 농도 5 NG / vortexing에 의해 ML 믹스 것입니다. methocel - 솔루션의 한 부분을 추가합니다. vortexing하여 섞는다.

4. 회전 타원체 포함땡땡

200 μl 피펫에, 팁 잘라 약 5mm가 200 μl 팁을 놓으십시오. 피펫 한 회전 타원체를 빨아 조심스럽게 빈 접시에 매체를 분배. 회전 타원체의 팁 내부 좋다면보세요. 회전 타원체는 흰색 점으로 표시됩니다. 플런저를 발표하지 않고, 100 μl 콜라겐 - methocel 혼합물을 빨아하고 콜라겐 - 코팅 잘 96에 콜라겐 혼합에있는 회전 타원체를 분배. 각각의 조건 12 spheroids에 대해이 작업을 수행합니다.
콜라겐, 37 적어도 30 분 응고하자 ° C
200 μl 팁과 공기 방울을 제거합니다.
1.6 %의 혈청 및 DMSO에 녹아있는 저해제와 중간의 50 μl를 추가합니다. SB - 431542에 대한 재고 솔루션을 4 μl (10 ㎜) 중간 1 ML로 추가합니다. 확산 후 억제제의 최종 농도는 10 μm의 것입니다. TGF - β와 억제제는 실험의 과정을 계속합니다. 40X 배율을 사용하여 현미경 spheroids 사진을 가져가라.
사 후TGF - β 및 / 또는 억제제와 자극의 8h는 40X 배율을 이용하여 현미경 spheroids의 사진을 찍을.
이일 후에 침해 spheroids의 영역을 측정하고 시작 영역을 뺍니다. 의 영역을 측정 회전 타원체 : 어도비 포토샵 확장 (그림 2A)의 회전 타원체의 사진과 빠른 선택 도구 (그림 2B)을 선택 엽니다. '플러스'(+) 기호 (그림 2C)와 동그라미에 마우스 포인터가 변경됩니다. 회전 타원체 위에 커서를 드래그하는 동안 포토샵은 회전 타원체의 경계를 인식합니다. (-) 도구 모음에서 로그인 회전 타원체 외부 영역을 선택한 경우,이 지역은 Alt 키를 눌러 또는로 표시됩니다 부정적인 선택 도구를 사용하여 선택에서 제외시킬 수 있습니다. (-) '마이너스'로 동그라미에 커서 변경 서명하고 잘못 선택한 영역 위로 커서를 드래그하여,이 지역은 선택 (그림 2D)에서 제거됩니다. 필요한 여러 영역 쉬를 눌러 선택할 수있다면ift의 버튼을 클릭합니다. 더 정확하게 해결하려면 마우스 포인터의 크기는 도구 모음에서 브러쉬 직경 (그림 2E)을 변경하여 조정할 수 있습니다. 전체 회전 타원체를 선택하면, 선택 영역은 메뉴 막대에 분석 법안을 통해 또는 Ctrl + Shift + M (그림 2F)를 눌러 계산됩니다. 측정 기록 창에 파일 이름과 픽셀 선택 영역뿐만 아니라 다른 데이터 (그림 2G)를 보여주는 표시됩니다. 여러 선택이 측정하는 경우, 첫 번째 라인은 모든 영역의 합계를 보여줍니다. 개인 선택의 측정은 아래 라인에 제공됩니다. 모든 측정 데이터는 텍스트 파일에 수출 및 Excel에서 열 수 있습니다.

5. 대표 결과 :

MCF10A1 (M1) 정상 유방 상피 세포와 회전 타원체 분석의 예를 들어 H - RAS는 MCF10AneoT (M2) 세포를 변환하고 M2 - 파생 MCF10CA1a (M4)는 그림 3에 있습니다. M1 세포없이 오직 약한 침략를 보여주자극하지만, 상당히 침공 TGF - β로 자극에 더. 대조적으로, M2는 자극의 추가없이 효율적으로 이미 침략 M1 - 유도체 RAS - 변환, 그리고 이것은 더 TGF - β 치료시 4-5 배 증가했다. M4 세포 모두와 TGF - β 이외없이 강한 침공을 보여주었다.

다음, 우리는 화학 억제제를 사용하여이 회전 타원체 모델에서 TGF - β - 유발 침공에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사했다. 이러한 목적을 위해 우리는 SB - 431542, ATP의 아날로그 및 TβRI의 키나제 활동의 선택적 억제제뿐만 아니라, activin 유형 IB 수용체 (ActRIB)와 activin 키나제와 같은 수용체 (하시죠) 7 ^12를 사용합니다. 예상했던대로, SB - 431542는 potently M1의 TGF - β - 유발 침공, 그 TGF - β - 유발 침략을 나타내는 M2와 M4 세포 (그림 4), TβRI - 키나제 저해 종속됩니다. 또한, spheroids의 기초 침공도 강하게 저해했다, 그 기저 침공을 제안하는 데 또한TGF - β에 늘어뜨린.

3D 회전 타원체 분석의 그림 1. 플로우 차트. 첫째, 세포는 U - 모양의 정지 플레이트에서 비 점착 성의 조건 하에서 도금입니다. 세포는 multcellular spheroids에 aggregrate과 콜라겐 매트릭스에 삽입하실 수 있습니다. 이 콜라겐 매트릭스에, 그들은 침략 수 있습니다.

그림 2. 어도비 포토샵을 사용하여 spheroids의 지역의 부량가 확장. (A) 회전 타원체의 그림을 사용하여 wongly 포함된 영역의 회전 타원체 (D) 제거 영역을 선택 회전 타원체 위에 커서를 드래그 빠른 선택 도구 어도비 포토샵 Extendend (B) 선택 (C)에서 열립니다 더 정확하게 영역을 선택하는 빠른 선택 도구의 브러쉬 크기의 부정적인 빠른 선택 도구 (E) 조정 (F)가 선택측정 명령 (G) 측정 기록의 예를 기록합니다.

그림 3. 저절로 불후의 MCF10A1 (M1) (A)의 spheroids의 TGF - β - 유발 침공, MCF10AneoT (M2 (B) 및 전이성 파생 MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2와 M4 spheroids는 임베디드 RAS - 변환 표시된로 콜라겐으로 48h에 대한 TGF - β의 5ng/ml로 치료했다. AC 대표 사진 포함의 하루 촬영하고 이틀 후. D 상대 공격이 2 일 마이너스 일 0에 지역 차이로 계량되었습니다. 결과 표현 같은 의미 ± SD ^13에서 적응.

그림 4A
그림 4B
그림 4. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 및 TGF - β - 유도된 회전 타원체의 침공은 B를 저해합니다Y SB - 431542. M1, M2와 M4 spheroids은 콜라겐에 포함하고 5ng/ml TGF - β 및 표시 등 / 또는 10 μm의 SB - 431542로 치료했다. 이일 (A) 이후에 촬영한 대표 사진. 상대 침공은 2 일 마이너스 일 0 (B)에 지역 차이로 계량되었습니다. 결과는 말은 ± SD ^13에서 적응으로 표현됩니다.

Discussion

관심 없음 충돌하지 않습니다.

Disclosures

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

Acknowledgements

우리는 세포 라인을위한 시약 및 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 Intitute, 디트로이트, 미국)의 켄 이와타 (OSI 제약, 뉴욕, 미국)에게 감사하고 있습니다.

Materials

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
메틸 셀룰로오스	시그마 - 올드 리치	M0512
PureCol	고급 Biomatrix	5005 - B
산도 표시기 스트립	머크	9533
96 - 웰 정지 접시	Greiner 바이오 - 원	650 185
TC 접착 96 - 웰 접시	Greiner 바이오 - 원	655 180

References

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