의 시각화 Caenorhabditis Elegans 표피 구조

Summary

우리는 사는 표피를 시각화하는 방법을 제시 C. elegans 일반적으로 사용되는 적색 형광 염료 lipophilic DiI를 (1,1 '- dioctadecyl - 3, 3,3', 퍼클로레이트을 3'이 - tetramethylindocarbocyanine) 사용 C. elegans 환경 노출된 뉴런을 시각화합니다. 이 최적화된 프로토콜로, alae와 환상 cuticular 구조 DiI로 얼룩진 및 복합 현미경을 사용하여 관찰하고 있습니다.

Abstract

C.의 표피 elegans는 동물 ^1-4 외관을 둘러싸는 매우 강한 구조입니다. 표피는 환경에서 동물을 보호뿐만 아니라 몸 모양을 결정하고 운동성 ^4-6에서 역할을뿐만 아니라. 표피 세포에 의해 분비 여러 레이어 바깥쪽의 지질 층 ⁷ 포함하여 표피를 구성.

표피의 주변 산등성이는 annuli 패턴 동물의 길이라는 개발 ⁸ 모든 단계 동안 존재하고 있습니다. Alae는 L1, dauer, 그리고 성인 단계 ^2,9를 포함하여 발달의 특정 단계 동안 존재하는 세로 능선입니다. cuticular 콜라겐 조직에 영향을 유전자에 돌연변 cuticular 구조와 동물 신체 형태 ^5,6,10,11을 변경할 수 있습니다. DIC 광학과 복합 현미경을 사용하여 cuticular 이미지가 강조 가능한, 현재 방법이지만 cuticular 구조 fluores 포함센트 transgene 표현 ^12, 항체 염색법 ^13, 그리고 전자 현미경 ^1. 분류 밀 배아 agglutinin (WGA)도 cuticular glycoproteins을 시각화하는 데 사용되었지만 미세한 cuticular 구조 ¹⁴ 해결 제한됩니다. 형광 염료를 사용하여 표면의 얼룩 cuticular을 준수하지만, 세부 ¹⁵ 특징 적이되었습니다. 우리는 살아 C로 표피를 시각화하는 방법을 제시 일반적으로 C로 사용되는 적색 형광 염료 lipophilic DiI를 (1,1 '- dioctadecyl - 3, 3,3', 퍼클로레이트을 3'이 - tetramethylindocarbocyanine) 사용 elegans elegans은 환경 노출 뉴런을 시각화합니다. DiI의 얼룩에 대한이 최적화된 프로토콜은 고해상도 형광 annuli의 시각화, alae, 외음부, 남성 꼬리, 그리고 C로 남녀 추니 꼬리 증가를위한 간단하고 강력한 방법입니다 elegans.

Protocol

1. DiI의 준비 얼룩

1. DMF 20 밀리그램 / ML DiI (Biotium, 주식 회사, 헤이워드, CA)의 주식 솔루션을 준비합니다. DiI가 민감한 빛이기 때문에 호일에 포장하여 빛으로부터 DiI를 보호합니다.
2. 각 인구 399.4 μL M9 0.6 μL DiI 주식을 추가하여 DiI의 작업 희석를 만듭니다. 이것은 30 μg / M9에 ML DiI의 최종 작업 희석를 제공해야합니다. 이것은 동시에 여러 인구를 얼룩에 확장할 수 있습니다. 호일에 튜브 (들)을 포장하여 빛으로부터 쉴드 DiI.

2. nematodes의 준비

1. 오염 nematodes의 인구를 포함하는 60mm 플레이트를 사용하십시오. 부드럽게 모든 애벌레와 성인 동물을 풀어야 접시의 표면에 걸쳐 원형 운동에 액체를 소용돌이로 M9 버퍼에서 0.5 % 트라 이튼의 솔루션 X - 100을 사용하는 접시에서 동물을 씻으십시오. 멸균 1.5 ML 튜브로 세척을 전송합니다.
2. 즉시 30 초 2000 RPM에서 동물을 돌린다. 많이 먹어 볼래요 제거하고 폐기튜브의 하단에있는 동물의 질량을 방해하지 않고 가능한 ernatant.
3. 잔여 트리톤 X - 100을 줄이기 위해, M9 버퍼,....

Discussion

여기에 제시 DiI의 얼룩 방법은 C. elegans의 표피를 시각화하기 위해 상대적으로 신속하고 편리하게 얻을 수 있습니다. 일반적으로 이미지의 환경 노출 감각 뉴런 ^15,17하는 데 사용하는 방법을 repurposing 및 최적화함으로써, DiI는 찬란 alae와 환상 구조 (그림 1 및 2)뿐만 아니라 외음부, 남성 꼬리, 그리고 남녀 추니 꼬리 스파이크를 모두 얼룩하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 3). 우리는 DiI 능력 배양 솔루션과 시간에 영향이 일관되게 표피 (표 1, 그림 4) 얼룩 것으로 나타났습니다. DiI 얼룩 환경 노출 뉴런에 대한 방법은 트리톤 X - 100 ¹⁵ M9에 두 시간 부화 시간을 사용합니다. 계면 활성제와 함께 M9의 초기 세척는 Triton X - 100은 cuticular 표면에서 오염을 제거하는 데 도움과 clumping에서 동물을 방지할 수 있습니다. 그러나, 동일한 버퍼에 얼룩 솔루션 동물 세 시간 잠복기하면 표피 (표 1).......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약	동의어	회사	카탈로그 번호	댓글
DiI	1,1 '- Dioctadecyl - 3, 3,3', 3' - tetramethylindocarbocyanine 퍼클로레이트	Biotium 주식 회사	60,010	주식 희석 : DMF 20 밀리그램 / ML 작업 희석 : 30 밀리그램 / ML
DMF	Dimethylformamide	시그마 - 올드 리치 주식 회사	D4551
소라 고둥 X - 100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR 인터내셔널, LLC.	EM - 9410
M9	22mM KH 2 PO 4 42mM 나 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1mM MgSO 4
NGM	선충류 성장 매체	IPM 과학 주식 회사	11006-501	NGM 한천 프로토콜 18 다음 준비할 수
한천 - 한천		EMD 화학 주식 회사	1.01614	물에 4%
Levamisole	Levamisole 하이드로 클로라이드	시그마 - 올드 리치 주식 회사	31,742	100 μm의 - 필요에 따라 1 ㎜의 levamisole
현미경 슬라이드		VWR 인터내셔널, LLC.	16005-106
현미경 커버 안경		VWR 인터내셔널, LLC.	16004-302
컴파 운드 범위		칼 자이스 혈구, 주식 회사	A1m	실험의 필요에 맞게 목표를 사용하여
TRITC 또는 기타 호환 필터	및nbsp;	채도 기술 주식 회사	49,005	동부 표준시 - DSRed (TRITC/Cy3)는 필터 세트를 sputtered