방법 논문

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

DOI:

10.3791/3399

⸱

2011년 11월 17일

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

초록

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아라키돈산(AA) 및 리놀레산(LA)과 같은 지방산의 대사는 수많은 입체이성체를 포함하여 산화된 생체 활성 지질의 형성을 초래합니다1,2. 이러한 대사 산물은 유리 또는 에스테르화 지방산으로 형성될 수 있습니다. 이러한 산화된 대사 산물의 대부분은 생물학적 활성을 가지고 있으며 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 천식 및 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다3-7. 산화된 생체 활성 지질은 효소 또는 활성산소종(ROS)에 의해 형성될 수 있습니다. 지방산을 대사하는 효소에는 사이클로옥시게나제(COX), 리폭시게나제(LO) 및 시토크롬 P450(CYPs)1,8이 있습니다. 효소 대사는 거울상 선택적 형성을 초래하는 반면 ROS 산화는 제품의 라세미 형성을 초래합니다.

이 프로토콜은 주로 AA 및 일부 LA 유래 생체 활성 대사 산물의 분석에 중점을 둡니다. 다른 지방산의 대사 산물에 쉽게 적용될 수 있습니다. 생체 활성 지질은 액체-액체(L-L) 추출을 사용하여 세포 용해물 또는 배지에서 추출됩니다. l-l 추출 공정 초기에는 시료 전처리 중 오류를 설명하기 위해 안정 동위원소 내부 표준물질이 추가됩니다. 안정 동위원소 희석(SID)은 또한 질량분석법(MS) 분석9 중에 대사 산물이 경험할 수 있는 이온 억제와 같은 차이를 설명합니다. 추출 후 전자 포획(EC) 시약인 펜타플루오릴벤질 브로마이드(PFB)를 사용하여 검출 감도를 높입니다10,11. 다중 반응 모니터링(MRM)은 MS 분석의 선택성을 높이는 데 사용됩니다. MS 분석 전에 키랄 순상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 지질을 분리합니다. HPLC 조건은 모니터링된 지질12의 거울상 이성질체와 다양한 입체이성체를 분리하도록 최적화되어 있습니다. 이 특정 LC-MS 방법은 프로스타글란딘(PG), 이소프로스탄(isoP), 히드록시에이코사테트라엔산(HETE), 하이드록시옥타데카디에노산(HODE), 옥소에이코사테트라엔산(oxoETE) 및 옥소옥타데카디에노산(oxoODE)을 모니터링합니다. 그러나 HPLC 및 MS 매개변수는 모든 지방산 대사 산물을 포함하도록 최적화할 수 있습니다13.

현재 사용 가능한 대부분의 생물 분석 방법은 거울상 이성질체의 별도 정량화를 고려하지 않습니다. 이것은 대사 산물이 효소로 형성되었는지 아니면 ROS에 의해 형성되었는지 여부를 추론하려고 할 때 매우 중요합니다. 또한, 거울상 이성질체의 비율은 특정 효소 형성 경로에 대한 증거를 제공할 수 있습니다. SID를 사용하면 대사 산물을 정확하게 정량화할 수 있으며 전처리 중 샘플 손실과 이온화 중에 발생하는 차이를 설명할 수 있습니다. PFB 전자 포획 시약을 사용하면 기존 APCI 방법보다 검출 감도가 두 자릿수 증가합니다. 전반적으로 이 방법인 SID-LC-EC-대기압 화학 이온화 APCI-MRM/MS는 생체 활성 지질에 대한 가장 민감하고 선택적이며 정확한 정량 방법 중 하나입니다.

프로토콜

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1. 표준 및 내부 표준 믹스

  1. 지질 추출 전에 표준 혼합물(SM)과 내부 표준 혼합물(ISM)을 준비해야 합니다. SM의 경우, 보정된 주사기를 사용하여 아래 시약 표에 나열된 각 표준물질(총 25개)의 1μg과 동등한 부피를 10mL 부피 플라스크에 분취합니다. 표준물질을 질소로 건조시키고 10mL의 아세토니트릴(ACN)로 재용해합니다. 표준 혼합물의 최종 농도는 100pg/μL입니다. 1mL 부분 표본으로 나누고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  2. 이 표준 혼합물에서 총 7개의 보정 표준(1pg/ μL, 2pg/ μL, 5pg/ μL, 10pg/ μL, 20pg/ μL, 50pg/ μL 및 100pg/ μL)에 대해 6개의 표준 희석을 만들 수 있습니다. 이러한 표준은 정량 분석에 사용되는 검량선을 개발하기 위해 준비된 각 샘플 배치와 함께 실행됩니다.
  3. ISM의 경우, 아래 시약 표에 나열된 각 IS(총 14개)의 1μg과 동등한 부피를 보정된 주사기를 사용하여 10mL 부피 플라스크에 분취하고 질소로 건조합니다. ACN 10mL에서 ISM을 재구성하고 1mL 부분 표본으로 나눕니다. ISM의 최종 농도는 100pg/μL이어야 합니다. 1000개의 샘플을 처리할 수 있는 충분한 ISM이 있습니다.
  4. SM 및 I....

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토론

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이 프로토콜에 사용된 표준 및 내부 표준은 표적 지질체학 방법을 나타냅니다. A: LC-MS 분석에는 Waters 2695 분리 모듈과 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra가 사용되었으며 최적의 파라미터 설정은 표 1 및 2에서 확인할 수 있습니다. 또한 이 추출 프로토콜은 부착 세포용으로 설계되었지만 소변, 혈액 및 조직을 포함한 다른 생물학적 매트릭스뿐만 아니라 다른 세포 유형에 대해 수정될 수 있습니다. 많은 지질 표준이 상업적으로 이용 가능하며 이 분석에 통합될 수 있습니다. 유도체화 절차의 경우 무수 용매와 최고 순도 N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하는 것이 중요합니다. LC-MS 분석의 경우 최고 순도의 용매를 사용하는 것도 중요합니다. 이러한 용매는 시약 목록에 나열되어 있습니다. 메탄올의 사후 컬럼 첨가는 코로나 바늘에 증착이 축적되는 것을 방지하는 데에도 중요하므로 분석법의 감도를 크게 감소시킵니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 활성 지질 측정에 사용할 수 있는 대부분의 최신 생물 분석 방법은 키랄 순상 크로마토그래피 또는 SID를 포함하지 않기 때문에 광범위하지 않습니다. 키랄 순상 LC는 거울상 이성질체의 분리와 효소 또는 ROS 매개 대사를 구별할 수 있는 능력에 중요합니다. SID를 사용하면 추출 또는 분석 중에 발생하는 인적 오류나 합병증이 정량화 중에 고려됩니다. ECAPCI-MRM과 함께 이러한 추가 성분으로 인해 이 방법은 생체 활성 지질 분석에 사용할 수 있는 가장 민감하고 선택적인 방법입니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 산케이맨 화학334250[2H7]-5-ox–TE 내부 표준
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산케이맨 화학334230[2H8]-5(S)-HETE 내부 표준
12S-하이드록시-5Z,8Z,10E,14Z-에이코사테트라렌산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산케이맨 화학334570[2H8]-12(S)-HETE 내부 표준
15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산케이맨 화학334720[2H8]-15(S)-HETE 내부 표준
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,18,18-d6 acidCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE 내부 표준
9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acidCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE 내부 표준
13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 산케이맨 화학338610[2H4]-13(S)-HODE 내부 표준
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산Cayman Chemical316010[2H4]-PGF2α 내부 표준
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산케이맨 화학316350[2H4]-8-iso-PGF2a 내부 표준
9α,11β.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산케이맨 화학10008989[2H4]-11β-PGF2 내부 표준
9α, 15S-디하이드록시-11-옥소-프로스타-5Z,13E-디엔-1-오익-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 산케이맨 화학312010[2H4]-PGD2 내부 표준
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산케이맨 화학314010[2H4]-PGE< sub>2 내부 표준
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acidCayman Chemical320110[2H4]-LTB4 내부 표준
9α,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 내부 표준
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical342505-ox–TE Standard
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3458012-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산케이맨 화학3473015-ox–TE 표준
5R-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산케이맨 화학342255(R)-HETE 표준
5S-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산케이맨 화학342305(S)-HETE 표준
8R-하이드록시-5Z,9E,11Z, 14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical343508(R)-HETE 표준
8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical343608(S)-HETE 표준
11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3450511(R)-HETE 표준
11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, 14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3451011(S)-HETE 표준
12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3456012(R)-HETE 표준
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3457012(S)-HETE 표준
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, 13E-에이코사테트라엔산케이맨 화학3471015(R)-HETE 표준
15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산케이맨 화학3472015(S)-HETE 표준
20-하이드록시-5Z,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산케이맨 화학9003020-HETE 표준
9R-하이드록시-10E,12Z-옥타데카디에노산케이맨 화학384059 (< > R< / em>) -HODE 표준
9S-hydroxy-10E, 12Z-octadecadienoic acidCayman Chemical384109 ( S< / em>) -HODE 표준
13R-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acidCayman Chemical3860513 ( R< / em>) -HODE Standard
13S-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acidCayman Chemical3861013 ( S < / em >) -HODE 표준
9 α , 11 α , 15S - 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산케이맨 화학16010PGF < 서브 > 2 α 기준
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical163508-iso-PGF2α 표준
9 α , 11 &# 946; , 15S- 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산케이맨 화학1652011 &# 946; -PGF < 서브 > 2 < / 서브 > 표준
9 α , 15S- 디 하이드 록시 -11- 옥소 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산케이맨 화학12010PGD < 서브 > 2< / 서브 > 표준
9- 옥소 -11 &알파, 15S- 디 하이드 록시 - (8 &# 946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical143508-iso-PGE2 Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical14010PGE2 Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical20110LTB4 Standard
9α,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical19030TxB2 Standard
Phosphate Buffered SalineGIBCO, by Life14190
디에틸 에테르시그마-알드리치346136
디클로로메탄아크로스 유기물61030-1000무수
N,N-디이소프로필에틸 아민시그마-알드리치387649
펜타플루오릴벤질 브로마이드시그마-알드리치101052
염산시그마-알드리치320331
수산화칼플루카00650
아세토니트릴피셔 사이언티픽A996-4
메탄올피셔 ScientificA454-4
클로로포름Fisher Scientific366927
HexaneFisher ScientificH303-4
이소프로판올Fisher ScientificA464-4
에탄올Decon Laboratories2716
WaterFisher ScientificW7-4
파스퇴르 피펫Fisher Scientific13-678-200
10 mL 유리 원심분리기 튜브Kimble Chase73785-10스크류 캡
페놀 스크류 캡Kimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH 컬럼Chiral Technologies19325
HPLC 바이알Waters60000751CV
HPLC 인서트WatersWAT094171
Technologies 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products....

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