이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
아라키돈산(AA) 및 리놀레산(LA)과 같은 지방산의 대사는 수많은 입체이성체를 포함하여 산화된 생체 활성 지질의 형성을 초래합니다1,2. 이러한 대사 산물은 유리 또는 에스테르화 지방산으로 형성될 수 있습니다. 이러한 산화된 대사 산물의 대부분은 생물학적 활성을 가지고 있으며 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 천식 및 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다3-7. 산화된 생체 활성 지질은 효소 또는 활성산소종(ROS)에 의해 형성될 수 있습니다. 지방산을 대사하는 효소에는 사이클로옥시게나제(COX), 리폭시게나제(LO) 및 시토크롬 P450(CYPs)1,8이 있습니다. 효소 대사는 거울상 선택적 형성을 초래하는 반면 ROS 산화는 제품의 라세미 형성을 초래합니다.
이 프로토콜은 주로 AA 및 일부 LA 유래 생체 활성 대사 산물의 분석에 중점을 둡니다. 다른 지방산의 대사 산물에 쉽게 적용될 수 있습니다. 생체 활성 지질은 액체-액체(L-L) 추출을 사용하여 세포 용해물 또는 배지에서 추출됩니다. l-l 추출 공정 초기에는 시료 전처리 중 오류를 설명하기 위해 안정 동위원소 내부 표준물질이 추가됩니다. 안정 동위원소 희석(SID)은 또한 질량분석법(MS) 분석9 중에 대사 산물이 경험할 수 있는 이온 억제와 같은 차이를 설명합니다. 추출 후 전자 포획(EC) 시약인 펜타플루오릴벤질 브로마이드(PFB)를 사용하여 검출 감도를 높입니다10,11. 다중 반응 모니터링(MRM)은 MS 분석의 선택성을 높이는 데 사용됩니다. MS 분석 전에 키랄 순상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 지질을 분리합니다. HPLC 조건은 모니터링된 지질12의 거울상 이성질체와 다양한 입체이성체를 분리하도록 최적화되어 있습니다. 이 특정 LC-MS 방법은 프로스타글란딘(PG), 이소프로스탄(isoP), 히드록시에이코사테트라엔산(HETE), 하이드록시옥타데카디에노산(HODE), 옥소에이코사테트라엔산(oxoETE) 및 옥소옥타데카디에노산(oxoODE)을 모니터링합니다. 그러나 HPLC 및 MS 매개변수는 모든 지방산 대사 산물을 포함하도록 최적화할 수 있습니다13.
현재 사용 가능한 대부분의 생물 분석 방법은 거울상 이성질체의 별도 정량화를 고려하지 않습니다. 이것은 대사 산물이 효소로 형성되었는지 아니면 ROS에 의해 형성되었는지 여부를 추론하려고 할 때 매우 중요합니다. 또한, 거울상 이성질체의 비율은 특정 효소 형성 경로에 대한 증거를 제공할 수 있습니다. SID를 사용하면 대사 산물을 정확하게 정량화할 수 있으며 전처리 중 샘플 손실과 이온화 중에 발생하는 차이를 설명할 수 있습니다. PFB 전자 포획 시약을 사용하면 기존 APCI 방법보다 검출 감도가 두 자릿수 증가합니다. 전반적으로 이 방법인 SID-LC-EC-대기압 화학 이온화 APCI-MRM/MS는 생체 활성 지질에 대한 가장 민감하고 선택적이며 정확한 정량 방법 중 하나입니다.
프로토콜
1. 표준 및 내부 표준 믹스
- 지질 추출 전에 표준 혼합물(SM)과 내부 표준 혼합물(ISM)을 준비해야 합니다. SM의 경우, 보정된 주사기를 사용하여 아래 시약 표에 나열된 각 표준물질(총 25개)의 1μg과 동등한 부피를 10mL 부피 플라스크에 분취합니다. 표준물질을 질소로 건조시키고 10mL의 아세토니트릴(ACN)로 재용해합니다. 표준 혼합물의 최종 농도는 100pg/μL입니다. 1mL 부분 표본으로 나누고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
- 이 표준 혼합물에서 총 7개의 보정 표준(1pg/ μL, 2pg/ μL, 5pg/ μL, 10pg/ μL, 20pg/ μL, 50pg/ μL 및 100pg/ μL)에 대해 6개의 표준 희석을 만들 수 있습니다. 이러한 표준은 정량 분석에 사용되는 검량선을 개발하기 위해 준비된 각 샘플 배치와 함께 실행됩니다.
- ISM의 경우, 아래 시약 표에 나열된 각 IS(총 14개)의 1μg과 동등한 부피를 보정된 주사기를 사용하여 10mL 부피 플라스크에 분취하고 질소로 건조합니다. ACN 10mL에서 ISM을 재구성하고 1mL 부분 표본으로 나눕니다. ISM의 최종 농도는 100pg/μL이어야 합니다. 1000개의 샘플을 처리할 수 있는 충분한 ISM이 있습니다.
- SM 및 I....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에 사용된 표준 및 내부 표준은 표적 지질체학 방법을 나타냅니다. A: LC-MS 분석에는 Waters 2695 분리 모듈과 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra가 사용되었으며 최적의 파라미터 설정은 표 1 및 2에서 확인할 수 있습니다. 또한 이 추출 프로토콜은 부착 세포용으로 설계되었지만 소변, 혈액 및 조직을 포함한 다른 생물학적 매트릭스뿐만 아니라 다른 세포 유형에 대해 수정될 수 있습니다. 많은 지질 표준이 상업적으로 이용 가능하며 이 분석에 통합될 수 있습니다. 유도체화 절차의 경우 무수 용매와 최고 순도 N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하는 것이 중요합니다. LC-MS 분석의 경우 최고 순도의 용매를 사용하는 것도 중요합니다. 이러한 용매는 시약 목록에 나열되어 있습니다. 메탄올의 사후 컬럼 첨가는 코로나 바늘에 증착이 축적되는 것을 방지하는 데에도 중요하므로 분석법의 감도를 크게 감소시킵니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
생체 활성 지질 측정에 사용할 수 있는 대부분의 최신 생물 분석 방법은 키랄 순상 크로마토그래피 또는 SID를 포함하지 않기 때문에 광범위하지 않습니다. 키랄 순상 LC는 거울상 이성질체의 분리와 효소 또는 ROS 매개 대사를 구별할 수 있는 능력에 중요합니다. SID를 사용하면 추출 또는 분석 중에 발생하는 인적 오류나 합병증이 정량화 중에 고려됩니다. ECAPCI-MRM과 함께 이러한 추가 성분으로 인해 이 방법은 생체 활성 지질 분석에 사용할 수 있는 가장 민감하고 선택적인 방법입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 산 | 케이맨 화학 | 334250 | [2H7]-5-ox–TE 내부 표준 |
| 5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산 | 케이맨 화학 | 334230 | [2H8]-5(S)-HETE 내부 표준 |
| 12S-하이드록시-5Z,8Z,10E,14Z-에이코사테트라렌산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산 | 케이맨 화학 | 334570 | [2H8]-12(S)-HETE 내부 표준 |
| 15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산 | 케이맨 화학 | 334720 | [2H8]-15(S)-HETE 내부 표준 |
| 20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,18,18-d6 acid | Cayman Chemical | 390030 | [2H6]-20-HETE 내부 표준 |
| 9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acid | Cayman Chemical | 338410 | [2H4]-9(S)-HODE 내부 표준 |
| 13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 산 | 케이맨 화학 | 338610 | [2H4]-13(S)-HODE 내부 표준 |
| 9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산 | Cayman Chemical | 316010 | [2H4]-PGF2α 내부 표준 |
| 9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산 | 케이맨 화학 | 316350 | [2H4]-8-iso-PGF2a 내부 표준 |
| 9α,11β.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산 | 케이맨 화학 | 10008989 | [2H4]-11β-PGF2 내부 표준 |
| 9α, 15S-디하이드록시-11-옥소-프로스타-5Z,13E-디엔-1-오익-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 산 | 케이맨 화학 | 312010 | [2H4]-PGD2 내부 표준 |
| 9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산 | 케이맨 화학 | 314010 | [2H4]-PGE< sub>2 내부 표준 |
| 5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acid | Cayman Chemical | 320110 | [2H4]-LTB4 내부 표준 |
| 9α,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid | Cayman Chemical | 319030 | [2H4]-TxB2 내부 표준 |
| 5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34250 | 5-ox–TE Standard |
| 12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34580 | 12-ox–TE Standard |
| 15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 34730 | 15-ox–TE 표준 |
| 5R-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 34225 | 5(R)-HETE 표준 |
| 5S-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 34230 | 5(S)-HETE 표준 |
| 8R-하이드록시-5Z,9E,11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34350 | 8(R)-HETE 표준 |
| 8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34360 | 8(S)-HETE 표준 |
| 11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34505 | 11(R)-HETE 표준 |
| 11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, 14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34510 | 11(S)-HETE 표준 |
| 12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34560 | 12(R)-HETE 표준 |
| 12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 34570 | 12(S)-HETE 표준 |
| 15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, 13E-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 34710 | 15(R)-HETE 표준 |
| 15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 34720 | 15(S)-HETE 표준 |
| 20-하이드록시-5Z,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산 | 케이맨 화학 | 90030 | 20-HETE 표준 |
| 9R-하이드록시-10E,12Z-옥타데카디에노산 | 케이맨 화학 | 38405 | 9 (< > R< / em>) -HODE 표준 |
| 9S-hydroxy-10E, 12Z-octadecadienoic acid | Cayman Chemical | 38410 | 9 ( S< / em>) -HODE 표준 |
| 13R-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid | Cayman Chemical | 38605 | 13 ( R< / em>) -HODE Standard |
| 13S-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid | Cayman Chemical | 38610 | 13 ( S < / em >) -HODE 표준 |
| 9 α , 11 α , 15S - 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산 | 케이맨 화학 | 16010 | PGF < 서브 > 2 α 기준 |
| 9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 16350 | 8-iso-PGF2α 표준 |
| 9 α , 11 &# 946; , 15S- 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산 | 케이맨 화학 | 16520 | 11 &# 946; -PGF < 서브 > 2 < / 서브 > 표준 |
| 9 α , 15S- 디 하이드 록시 -11- 옥소 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산 | 케이맨 화학 | 12010 | PGD < 서브 > 2< / 서브 > 표준 |
| 9- 옥소 -11 &알파, 15S- 디 하이드 록시 - (8 &# 946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 14350 | 8-iso-PGE2 Standard |
| 9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 14010 | PGE2 Standard |
| 5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic acid | Cayman Chemical | 20110 | LTB4 Standard |
| 9α,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 19030 | TxB2 Standard |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life | 14190 | |
| 디에틸 에테르 | 시그마-알드리치 | 346136 | |
| 디클로로메탄 | 아크로스 유기물 | 61030-1000 | 무수 |
| N,N-디이소프로필에틸 아민 | 시그마-알드리치 | 387649 | |
| 펜타플루오릴벤질 브로마이드 | 시그마-알드리치 | 101052 | |
| 염산 | 시그마-알드리치 | 320331 | |
| 수산화칼 | 플루카 | 00650 | |
| 아세토니트릴 | 피셔 사이언티픽 | A996-4 | |
| 메탄올 | 피셔 Scientific | A454-4 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific | 366927 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| 이소프로판올 | Fisher Scientific | A464-4 | |
| 에탄올 | Decon Laboratories | 2716 | |
| Water | Fisher Scientific | W7-4 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 mL 유리 원심분리기 튜브 | Kimble Chase | 73785-10 | 스크류 캡 |
| 페놀 스크류 캡 | Kimble Chase | 73802-13415 | |
| Chiralcel ADH 컬럼 | Chiral Technologies | 19325 | |
| HPLC 바이알 | Waters | 60000751CV | |
| HPLC 인서트 | Waters | WAT094171 |
참고문헌
- Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
- Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
