방법 논문

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

DOI:

10.3791/3441

⸱

2011년 10월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Gottwald Center for the Sciences, University of Richmond, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Gottwald Center for the Sciences, University of Richmond

이 논문에서

요약

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monolayer 보호 클러스터 (MPCs)로 알려진 Alkanethiolate 안정화 황금 colloids은 합성 특징과 같은 간단한 산화 환원 단백질의 단백질 monolayer의 전기에 대한 흡착 인터페이스로 박막에 모였습니다 녹농균 azurin (AZ)와 시토크롬 C (cyt C).

초록

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콜로이드 골드는 단백질 monolayer의 전기 (PME)의 흡착 플랫폼 역할을 필름 어셈블리로 합성하고 이후 통합됩니다 monolayer 보호 금색 클러스터 (MPCs)라는 alkanethiolate 리간드로 보호 nanoparticles. PME는 전자 송금 (동부 표준시) 반응을위한 산화 환원 파트너로서 역할을 수정 전극에서 흡착 플랫폼을 confining하여 산화 환원 단백질의 전기 특성을 공부를위한 모델 시스템으로 활용됩니다. 연구는이 자연의 황금 nanoparticle 필름 어셈블리가 더 균일한 단백질 흡착 환경을 제공하고 alkanethiol 자기 조립 monolayers (SAM)로 수정보다 전통적인 시스템에 비해 거리 의존하지 않고 동부 표준시를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 1-3이 종이 MPCs에서 hexanethiolate 리간드가 수정된 부르 스트 반응 4를 사용하여 합성 및 자외선 가시 (UV - VIS) 분광, 전송 전자 현미경 (TEM), 그리고 양자 (1 H) 핵 자기 공명 (NMR)과 특징과 작용. MPC 필름은 MPC의 레이어와 dithiol 연결 분자를 교대의 "딥 사이클"메서드를 사용하여 SAM 수정된 골드 전극 인터페이스에서 조립됩니다. 금 전극에 영화의 성장은 시스템의 전류를 충전 더블 레이어의 변경 사항을 측정하여 electrochemically 추적됩니다. 실란 수정된 유리 슬라이드에 조립 유사한 영화는 예상 필름 두께를 제공합니다 영화의 성장과 교차 단면 TEM 분석의 광학 모니터링하실 수 있습니다. 필름 조립하는 동안, MPC의 리간드 보호 조작뿐만 아니라 내부의 연동 메커니즘은 서로 다른 흡착 메커니즘을 가지고 산화 환원 단백질과 인터페이스, 쉽게 적응 아르 네트워크 필름에 대한 수 있습니다. 예를 들어, 모나스 녹농균이라는 박테리아 azurin (AZ)는 hexanethiolate MPCs 및 시토크롬 C (cyt C) MPC 계면 층을 수정 카르복실산에 electrostatically 움직일 수의 dithiol 링크된 영화에 hydrophobically adsorbed 수 있습니다. 이 보고서에서는, 우리는 독점적 AZ 시스템 필름 프로토콜에 중점을두고 있습니다. MPC 플랫폼에서 수정된 합성 단백질의 흡착과 관련된 조사는 biomolecules과 인간이 만든 물질 사이의 상호 작용에 대한 이해를 더하고, 결과적으로 바이오 센서 구조, 동부 표준시 모델링 시스템 및 합성 biocompatible 물질의 개발을 원조 수 있습니다. 5-8

프로토콜

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1. Hexanethiolate Monolayer 보호 금 클러스터 합성

Hexanethiolate 작용 monolayer 보호 황금 클러스터 (MPCs)은 같은 끊을 225 (C6) 75 평균 구조를 생산하는 황금 두더지 비율 2시 1분 1 hexanethiol (C6). 부르 스트 반응에 4-9 특정 수정할 다음과 같은 합성 아르 리간드 유형, 특정 thiol - 투 - 황금 비율, 온도 및 반응 전달 속도, 또는 포스트 합성 트리 트먼트, 9-11은 각각 다양한 핵심 크기와 기능 보호 단체와 MPCs의 다양한 범위를 얻을 수 있습니다. 4 MPC의 대략적인 (을 다양한 alkanethiol 그룹으로 작용 MPCs의 평균) 작곡은 양성자 (1 H) 요오드 - 분해 시료의 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 의해 결정하실 수 있습니다.

  1. 적절한 연기 후드의 환기와 톨루엔의 30 ML 1.1 g의 tetraoctylammonium의 브로마이드 (TOABr)를 해산.
  2. 18 MΩ ultrapurified 물 (H 2 O UP)의 ~ 20 ML에서 0.38 g의 나트륨 borohydride (NaBH 4) 디졸브 최소한 30 분 이상 얼음 진정 수 있습니다.
  3. UP H 2 O 중 ~ 20 ML에서 0.31 g 수소 tetrachloroaurate (HAuCl 4) 분해하고 양적 솔루션 혼합물은 추가를 사용하여 TOABr - 톨루엔 용액으로 환승 ~ UP H 2 O 5 ML을 수성 금을 위상 전송하기 위해서는 nonaqueous 솔루션에 솔루션입니다. 번제 오렌지 수성 맑은 nonaqueous 단계가 잘 혼합되도록 가볍게 30 분 덮인 동안 엄격하게 저어.
  4. 분리 깔때기에 대한 명확한 수성과 번제 오렌지 nonaqueous 단계를 모두 전송합니다. 수성 (아래) 레이어와 가만히 따르다 깨끗한 플라스크로 nonaqueous (상단) 레이어를 폐기하십시오.
  5. nonaqueous 솔루션 HAuCl 4 2시 1분의 비율 C6을 추가합니다. 같은 엷은 노란색, 거의 무색의 용액으로 붉은 오렌지색의 컬러 변화로 감지 끊을 (I) 폴리머를 형성 30 분 저어.
  6. 0 ° C 감동과 함께 최소 30 분 절연 얼음 욕조와 진정 반응 혼합물을 전송합니다.
  7. 양적 빠르게 즉시 이외에 MPCs의 두꺼운 검은 솔루션을 형성 thiols의 면전에서 금속 황금색의 Au를 (I) 줄이기 위해 반응 혼합물에 차게 NaBH 4 솔루션을 추가합니다. 0 하룻밤 반응을 저어 ° C.
  8. , 분리 깔때기에 반응 혼합물을 전송 쓰레기 비커에 수성 (아래) 레이어를 삭제하고, 로타리 술병에 큰 검은 슬러지를 떠나 근처 완료 건조하는 nonaqueous (위) 톨루엔 레이어를 증발.
  9. acetonitrile를 추가하고 밤새 앉아 있도록하여 MPCs을 촉진.
  10. 고무 부품 및 흡인기와 사이드 무장 플라스크와 중간 다공성의 유리 프릿을 사용하여 진공 여과에 의해 MPCs를 수집하고 acetonitrile의 풍부한 양의 린스.
  11. 공기 건조 MPCs는, 제품의 무게를 전송 전자 현미경 (TEM)과 NMR 분석에 의해 특성, 그리고 저장소가 나중에 사용하기 위해 덮힌 수 있습니다. formvar / 구리 그리드 (400 메쉬) 및 80-100 kV에서 TEM 악기를 운영에 대한 탄소 지원 영화에 톨루엔에 용해 드롭 주조 MPCs하여 TEM 이미지를 얻습니다. 평균 코어 크기는 같은 이미지 J (프리웨어)와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추정 수 있습니다.

2. 필름 어셈블리 : 단백질 Monolayer의 전기에 대한 Dithiol 연결된 MPC 필름 조립

골드 기판 처음 electrochemically 몇 번 결국 dithiol 연결된 MPC 필름 어셈블리를 형성 반복되는 '딥 사이클 "을 만들길 dithiol 연결 분자와 C6 수정 MPCs의 솔루션을 번갈아에 immersing하기 전에 청소 및 C6 SAM과 수정 . 마찬가지로 이전의 연구에서 설명된 2가 녹농균 azurin (AZ) 단백질의 원래 플라스미드가 우아하게 라이스 대학과 AZ의 박사 코리 윌슨에 의해 주어졌다는 리치몬드 교수, 박사 조나단의 대학 정화와 동결 건조된 분말로 제공된 이후 자외선 볼 수 (UV - VIS) 분석에 의해 확인된대로 5-10 μm의 솔루션을 만드는 데 4.4 MM 인산 칼륨 완충액 (KPB, 산도 = 7.0, μ = 10 ㎜)과 rehydrated했습니다 Dattelbaum.

  1. 첫째 Lucite 리테이너 플레이트, 작업 전극으로 금 기판, 금 작업 전극에 황동 전기 접촉, 먼저 고무 가스켓, Viton 전극 영역을 정의하는 O - 링 : 아래쪽에서 위쪽으로 다음과 같은 순서로 전기 (echem) 샌드위치 셀을 조립 (0.32 cm 2), 유리 세포 기관, 초 고무 가스켓, 둘째 Lucite 리테이너 플레이트. 전체 세포는 스레드 봉에​​ 정신이 없는데, 조심스럽게 날개 너트를 강화합니다. 세포는 1 M KCl 포화, 자세 / AgCl 참조 와이어 및 PT 보조 전극 와이어와 유리 배럴을 전시하고 상업적으로 구입 기준 전극과 함께 장착되어 있습니다.
  2. Electrochemically 청소 일0.2에서 0.9 V 가능성 Windows에서 0.2-1.2 V, 및 0.2-1.35를 주기적 voltammetry (CV)를 수행하여 전자 골드 기판 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 0.1 MH 2 솔루션에 MV / s의 4 SO 및 0.01 M의 KCl.
  3. 0.1에서 0.4 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 스캔 KPB에서 MV / s의 1. 삭제를 KPB에 잠재적인 윈도우를 포함한 "표준 약관"에 CV를 수행하여 세척 베어 금 기판의 충전 전류를 측정하고 린스 연속와 H 2 H 2 O UP O, 에탄올 (EtOH), 그리고 EtOH UP.
  4. EtOH 5 MM의 C6 솔루션 ~ 300 μl로 청소 황금 기판을 폭로하고 주문 C6 SAM을 형성 밤새 앉아 수 있습니다. 세포에서 C6 솔루션을 취소하고 H 2 O, EtOH, 그리고 UP H 2 O. UP, EtOH로 연속 린스
  5. 표준 조건에서 SAM의 충전 전류를 측정합니다. KPB을 취소하고 H 2 H 2 O UP O, EtOH, 그리고 EtOH UP와 연속 린스. 충전 전류는 현저하게 베어 금 측정 (2.3 단계)의 감소에서해야 1.
  6. EtOH에서 1,9 - nonanedithiol (뉴펀들랜드 서머 타임) 솔루션 5 mm의 ~ 300 μl에 SAM 수정된 골드 기판을 폭로하고 C6 SAM 내의 분자를 연결 interdisperse 뉴펀들랜드 서머 타임에 1 시간을 위해 앉아 수 있습니다. 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션을 취소하고 H 2 O UP H 2 O, EtOH, 그리고 메틸렌 클로라이드 (CH 2 망할 CIA 2) UP, EtOH로 연속 철저하게 린스.
  7. 천천히 1 시간에 대한 N 2 가스 버블링하여 CH 2 MPC 솔루션 동요와 함께 망할 CIA 2 (~ 1 MG / ML)로 골드 기판을 폭로. 필요한 경우 더 CH이 망할 CIA 2 증발 MPC 솔루션을 교체하십시오. 이것은 영화 어셈블리의 고정 MPC 층입니다. MPC 솔루션을 폐기하고 다시 CH 2 H 2 O UP 망할 CIA 2 및 KPB와 연속 린스.
  8. 표준 조건에서 MPC 층의 충전 전류를 측정합니다. KPB을 취소하고 H 2 O 및 CH 2 망할 CIA 두 UP와 연속 린스.
  9. 천천히 20 분에 대한 N 2 가스 버블링하여 CH 2 교반과 망할 CIA 2 5 MM의 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션 ~ 300 μl에 금을 기판을 폭로.
  10. 뉴펀들랜드 서머 타임과 CH 2 망할 CIA 2와 린스 철저하게 폐기하십시오. 영화 어셈블리의 두 번째 MPC 계층을 입금하는 단계 2.7 및 2.8을 반복합니다.
  11. 추가 MPC 레이어, 단계 2.9과 2.10을 입금하기 위해서는 반복됩니다. 각 추가 MPC 계층과 충전 전류에 상응하는 증가가 관찰됩니다.
  12. 네트워크 MPC 영화가 완료되면, KPB와 필름 수정 기판 린스. AZ 단백질은 echem 샌드위치 셀로 KPB의 ~ 5-10 μm의 AZ 솔루션 ~ 150 μL를 주입하고 뒤덮힌 최소한 1 시간을 위해 냉장 앉아 있도록하여 MPC 필름 조립에 adsorbed 수 있습니다.
  13. 냉장고에서 echem 세포를 제거하고 근처 상온으로 돌아갑니다 수 있습니다. 철저하게 10 분에 대한 N 2 가스 KPB, KPB와 리필 echem 세포 및 거품 KPB와 린스.
  14. 단백질 monolayer 전기 연구가 0.25로 -0.25 V에서 잠재 창에서 이력서로 수행되는 V (대 자세 / AgCl, KCl) 100 스캔 뮤직 비디오 / KPB에서 초.

3. 필름 조립 : 광학 추적 Dithiol 연결된 MPC 필름 조립

사전 광학 평가를위한 MPC 필름을 성장하는 유리 슬라이드 섹션은 피라 냐가 솔루션 (CAUTION! 2시 1분는 4 H 2 O 2 SO H 2 집중되어)로 사전 세척 및 (3 mercaptopropyl) trimethoxysilane (3 MPTMS로 취급됩니다 .) 1-2 MPC 필름은 다음 이러한 수정 유리에 모였습니다 이전에 위에서 설명한 "딥 사이클"기법을 사용하여 슬라이드.

  1. CH이 망할 CIA 2 3 MPTMS 수정 유리 슬라이드를 씻어과 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 CH 2 MPC 솔루션 망할 CIA 2 (~ 1 MG / ML) 1 시간을 위해 그것을 놓으십시오. 이것은 실란의 mercaptans의 endgroups에 MPCs를 고정하여 영화 어셈블리의 첫 번째 MPC 레이어를 완료합니다. CH이 망할 CIA 2, N 2 가스로 건조와 철저하게 슬라이드를 씻어. 슬라이드의 UV - VIS 스펙트럼을 (400-1000 nm의에서) 가지고, CH 2 망할 CIA 2 다시 린스.
  2. 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 1 시간에 대한 채널이 망할 CIA 2 5 MM의 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션에있는 슬라이드를 삽입합니다. CH이 망할 CIA 2와 슬라이드를 씻어.
  3. 낮은 속도로 흔드는에 agitating 동안 1 시간에 대한 MPC 솔루션에있는 슬라이드를 삽입합니다. 이것은 영화 어셈블리의 두 번째 MPC 레이어를 완료합니다. CH이 망할 CIA 2, N 2 가스로 건조와 철저하게 슬라이드를 씻어과 슬라이드의 UV - VIS 스펙트럼을 (400-1000 nm의에서) 받아. 추가 MPC 레이어는 필름 어셈블리에 adsorbed대로 스펙트럼에 걸쳐 흡광도가 증가한다.
  4. 추가 MPC 레이어, 세인트를 입금EPS 3.2-3.3이 반복됩니다.

4. Monolayer의 특성은 교차 단면 전송 전자 현미경에 의한 골드 클러스터 필름 어셈블리를 보호

TEM 크로스 섹션이 다시 포함 EN 얼굴 임베디드 영화 2. 12 이것은 먼저 깨끗한 표준 현미경에 3 MPTMS 수정 유리 슬라이드에 조립 MPC 필름을 부착하여 이루어집니다 의해 준비가되어 있도록 퍼가기 812 에폭시 수지를 사용하여 슬라이드 아래의 절차를 수행하는 동안 처리를 향상되었습니다. 높은 온도가 영화 내에서 MPCs를 분해되므로 적용 열과 함께주의를 사용하십시오.

  1. 혼합 비율은 812 에폭시 수지를 삽입하고 적어도 12 시간에 대한 진하게 수 있습니다.
  2. 에폭시 수지와 "00"BEEM 캡슐을 입력하고 MPC 필름 샘플 (섹션 3 준비)의 상단에 반전. 거품은 에폭시 수지와 MPC 필름 샘플 사이에 인감을 생성, 캡슐의 상단에 상승 있도록 캡슐에 장소 압력. 60 이상 18 시간을위한 중합 허용 ° C 그리고 실내 온도에 탑재된 슬라이드를 냉각.
  3. 열 ° C 연결된 MPC EN 얼굴 영화와 블록의 제거를 용이하게하기 위해 200 주조 알루미늄 철판에서 20 초에 대한 슬라이드를 마운트.
  4. 보석의 본을 사용하여 BEEM 캡슐 블록의 필름을 포함하는 샘플을 잘라요.
  5. 물론 실리콘의 내부를 만나게 MPC 필름 면을 실리콘 아파트 금형에 다시 삽입 제거 부분. 실온에서 에폭시 수지와 잘 실리콘을 채워 60 적어도 18 시간을위한 중합 수 있도록 ° C. 실내 온도 샘플을 좋았어.
  6. 칼의 가장자리에 수직 섹션을 잘라 다이아몬드 나이프를 사용하여 Leica UCT ultramicrotome에서 60-80 nm의 얇은 샘플 섹션을 구합니다.
  7. 장소 formvar / 구리 그리드 (400 메쉬)에 탄소 지원 필름 섹션을 얇게하고 MPC 필름 어셈블리 준비 크로스 섹션의 TEM 이미지를 가져가라.

5. 대표 결과 :

figure-protocol-1
5 마른주기 (MPC와 뉴펀들랜드 서머 타임 솔루션 노출을 교대)의 총 MPC 필름 성장 전류 모니터링 충전 1 개의 더블 레이어를 그림. 충전 전류는 (그림 2) 필름 MPC의 "레이어"를 추가, 각 수영 사이클과 함께 체계적으로 증가했다. 주기적 voltammograms는 V이 (대 자세 / AgCl, KCl) 4.4 MM의 인산 칼륨 버퍼에 MV / S (산도 = 7.0, μ = 10 ㎜) 100 스캔 0.1에서 0.4로 잠재적인 윈도우를 사용하여 수집되었습니다. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회.

figure-protocol-2
그림 2 dithiol 연결된 MPC 필름 어셈블리에 adsorbed AZ 단백질의 (A) 도식 표현. (B) MPC 필름 어셈블리에 adsorbed AZ에 대한 일반적인 순환 voltammogram는 V이 (대 자세 / AgCl, KCl) 4.4 MM의 인산 칼륨 버퍼 (산도가 = 7.0에서 100 MV / s의 스캔 -0.25에서 0.25로 가능성이 윈도우를 사용하여 수집 μ = 10 ㎜).

figure-protocol-3
3 MPTMS 수정 유리 슬라이드에 dithiol 연결된 MPC 영화 성장의 그림 3 UV - VIS 대표 스펙트럼 모니터링. 딥 사이클 링커 솔루션 MPC 솔루션에 노출을 따라 뉴펀들랜드 서머 타임에 유리 슬라이드의 노출로 구성되어 있습니다. 필름 두께의 성장과 동시 흡광도 증가의 각 후속 딥 결과입니다. 딥 사이클 증가로 표면 plasmon 밴드는 점차 ~ 520 nm의에서 정의됩니다. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회.

figure-protocol-4
dithiol - 연결된 MPC 필름 어셈블리의 그림 4 전송 전자 현미경 (TEM) 교차 단면 이미지 분석. 삽입 : 영화 어셈블리에서 사용 hexanethiolate 작용 MPCs의 일반적인 TEM 이미지. TEM 분석 이미지 J 분석을 사용하여 ~ 2 nm의 수 MPCs의 평균 골드 코어 직경을 결정. ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB 마크, NT 로렌스, ML Trawick, 그리고 MC 레오폴드, Langmuir 26 일 (1), 560-569의 허가 Reprinted. 저작권 2010 미국 화학 학회.

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토론

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단백질 monolayer의 전기는 산화 환원 단백질과 합성 흡착 플랫폼 사이의 상호 작용을 연구하는 데 효과적인 기술이다. 이 전략의 효과 그러나, 분자 수준의 제어 높은 수준의 흡착 인터페이스를 엔지니어 수있는 능력에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서 만든 MPC 기반 플랫폼보다 동질적인 단백질 흡착 환경 세를 제공하고 alkanethiolate SAMs를 고용 전통 PME 시스템에 비해 더 멀리 둘 이상의 동부 표준시를 촉진하실 수 있습니다 특별히 설계 플랫폼을 나타냅니다. 전기 인터페이스와 MPC 영화 어셈블리의 장점은 다양한 크기 및 표면 화학 / 기능, 각종 다양한 nanomaterials하고,뿐만 아니라 다른 전극 구성의 다른 산화 환원 단백질의 다재 다능한하고 적응성이다. 예를 들어, 설명 절차는 쉽게 조립에 통합 MPCs의 가장 바깥쪽 레이어에 간단한 자리 교환 반응을 이용하여 시토크롬 C (cyt C)의 동부 표준시 연구에 적응합니다. cyt C가<...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 기꺼이 국립 과학 재단 (CHE - 0847145), 그리고 넉넉한이 연구를 지원하기위한 헨리 드레이 퓨 스를 교사 학술 상 프로그램을 인정합니다. 우리는 특별히 크리스틴 데이비스, 크로스 - 단면 영상과 함께 그녀의 도움 리치몬드 대학에서 생물의학과 현미경 및 이미징 이사를 인식하고 싶습니다. 특별 감사는 Drs에 주어집니다. T. 레오폴드, R. Kanters, D. 켈로그, R. 밀러, 그리고 W. 사례뿐만 아니라, 러스 콜린스, 필 조셉, 캐롤린 마크, 맨디 Mallory와 존 Wimbush - 모든이 대학에서 가능한 학부생 연구를하다 리치몬드의. 감사합니다 아주 개인은 레오폴드의 연구실에있는 모든 현재, 과거와 미래의 대학 연​​구자들에게 주어집니다.

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재료

시약 및 장비의 명칭 회사 카탈로그 번호
Tetraoctylammonium의 브로마이드 시그마 - 올드 리치 294,136
나트륨 borohydride 시그마 - 올드 리치 213,462
수소 tetrachloroaurate 시그마 - 올드 리치 254169 - 5G
1 Hexanethiol 시그마 - 올드 리치 234,192
전송 전자 현미경 JEOL 1010
핵 자기 공명 분광계 Bruker 이동한다 300 MHz의
구리 그리드 (400 메쉬)에 Formvar / 탄소 지원 필름 전자 현미경 과학 FCF400 - 잘라내기
골드 기판 증발 금속 영화 주식 회사 사용자 정의
AG / AgCl 참조 전극 Microelectrodes 주식 회사 MI - 401F
Potentiostats CH 인 스트 루먼트 주식 회사 CHI650A, CHI610B
1,9 - Nonanedithiol 시그마 - 올드 리치 N29805
(3 mercaptopropyl) trimethoxysilane 시그마 - 올드 리치 175,617
자외선 분광 표시 애질런트 8453
퍼가기 812 에폭시 수지 전자 현미경 과학 14,120
"00"BEEM 캡슐 전자 현미경 과학 70000 - B
실리콘 몰드 플랫 전자 현미경 과학 70,900
다이아몬드 나이프 Diatome 21 ULE, S12801

참고문헌

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