우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을 설명 C. elegans RNAi 기반 게놈 화면과 기능, fluorescently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 사용합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
C. elegans는 많은 유전자와 유전자 경로 1의 발견과 기능적 특성에 대한 유용한 모델 시스템 것으로 입증되었습니다. 보다 정교한 도구와이 시스템의 연구를위한 자원이 더 미묘한 phenotypes이나 역할과 유전자의 지속적인 발견을 촉진하고 있습니다.
여기에서 우리는 C를 식별 맞게 일반화된 프로토콜을 제시 RNAi 2를 사용 흥미 postembryonic phenotypes와 elegans의 유전자. 이 절차는 쉽게 여부 해부 또는 복합 현미경의 빛 또는 형광 광학에 의해 검정 선택의 표현형으로 수정됩니다. 이 심사 프로토콜은 유기체의 물리적 자산 및 분자 도구 C.에 capitalizes elegans 연구 커뮤니티하였습니다. 예를 들어, 우리는 이것의 일반적인 로컬 라이제이션에 필요한 유전자를 식별하기 위해 RNAi 화면에 형광등 제품을 표현하는 통합 transgene의 사용을 보여줍니다늦은 무대 애벌레와 어른의 제품입니다. 첫째, 우리는 전체 길이 cDNA 삽입으로 상용 게놈 RNAi 라이브러리를 사용했습니다. 이 라이브러리는 후보 유전자 산물의 RNAi 감소하여 여러 후보자의 급속한 식별을 용이하게합니다. 둘째, 우리는 RNAi를 구분 배경에 관심이 우리의 fluorecently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 올렸습니다. 셋째, RNAi에 부화 동물을 노출하여,이 화면은 특별히 관심 단백질을 규제에서 사후 배아 역할을 숨길 수있는 중요한 배아 역할을 유전자 제품의 식별을 허용합니다. 마지막으로,이 화면은 단세포 결의안에 대한 갖춘 복합 현미경을 사용합니다.
프로토콜
1. 상영 스트레인 공사
심사 변형의주의 디자인 화면의 성공에 중요하고 다른 곳에서 3 설명되었습니다. 일부 연구자의 경우 transgene에서 눈에 띄는 제품을 표현하는 변형을 사용하는 것은 실험을 위해 필요합니다. 통합 transgenes을 품고 많은 변종이 CGC 또는 개별 연구자로부터 구할 수 있습니다. 유전자 변형 변형율가 화면에 필요하지만, 사용할 수없는 경우, 그것은 충격 4, UV / TMP 5 또는 모스 transposon 삽입 6과 같은 출판 방법을 사용하여 생성할 수 있습니다. 관심의 단백질을 시각화하기 위해, 우리는 (우리가 dbl-1 시퀀스를 사용) 성숙 cDNA 시퀀스와 프레임에 GFP-코딩 순서를 삽입. 이 GFP 융합 단백질이 범위를 해부하여 표시되지이기 때문에, 우리는 가시였다 coinjection 마커를 사용하고 관심이 우리의 단백질의 감상에 영향을주지 않았다 (ttx-3P :: RFP 7을 참조하십시오. 그러면 extrachromosomal 배열에서 통합 transgene을 만들었습니다. 우리는 transgene의 충격은 역시 (Beifuss 및 Gumienny, 게시되지 않은) 해부....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기서 제시 RNAi 심사 방법은 정상적인 (또는 형질) postembryonic 표현형에 필요한 유전자 제품의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. 표시 예제 fluorescently 태그가 단백질의 subcellular 지방화에 관련된 유전자에 대한 화면입니다. 그러나,이 프로토콜은 관심사의 다른 postembryonic phenotypes에 영향을 미치는 유전자를 식별하기 위해 수정할 수 있습니다.
이 방법은 RNAi 라이브러리를 사용하여 후보 유전자 접근 방법을 이용합니다. 돌연변이 유발 기술을 사용하여 앞으로 유전 화면 무작위로 유도된 소설 대립 유전자를 식별하지만, 이러한 대립 유전자는 24을 식별하는 데 상당한 시간과 노력, 그리고 / 또는 자금을 필요로합니다. cDNA 라이브러리로, 반면에 관심이 RNAi의 표현형 빠르게 후보 유전자를 확인 의한 cDNA 삽입 순서. 또한 복제 가능한 cDNA 삽입이 확인된 후보자의 다운 스트림 분석을 용이하.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
저자 분사 마커에 대한 dbl-1 cDNA와 닥터 크리스토퍼 Rongo (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)의 선물 박사 릭 Padgett (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)에 감사드립니다. 닥터 바스 그랜트의 연구실에서 GFP-태그를 dbl-1 구조의 낮은 사본 번호 통합을위한 유전자 총기 포격을 수행. 르네 가르시아 연구실 texIs100의 창출 동안 기술 지원을 제공했습니다. 르네 가르시아, 로빈의 Lints 및 Hongmin 진 실험실 생산적인 조언을 제공했습니다. 이 작품은 분자 및 세포 의학 TAMHSC학과 시동 기금에 의해 자금 지원되었다. 화합물 범위와 회전 디스크 공촛점는 부서와 딘의 의학 사무소의 TAMHSC 대학에서 제공하는 자금으로 구입했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| NGM 한천 | 선충류 성장 매체 | IPM 과학, INC | NGM 한천 프로토콜 25 다음 준비할 수 |
| M9 중간 | 22mM KH 2 PO 4, 42mM 나 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 ㎜ MgSO 4 | 26 | |
| 한천 - 한천 | EMD 화학 주식 회사 | 1.01614.1000 | NGM 플레이트 물에 2 %. 현미경 슬라이드 패드를위한 물 4 % (초기 및 이후 녹기 전자 레인지 압력솥). |
| Bacto 펩톤 | Becton 디킨슨 - Difco CP | 211,677 | 0.25 % |
| IPTG | 연구 제품 국제 주식 회사 | I56000-5.0 | 1 ㎜ 최종 농도 |
| carbenicillin | 연구 제품 국제 주식 회사 | C46000-5.0 | 50 μg / ML 작업 희석 |
| LB 국물 레녹스 | Becton 디킨슨 - Difco CP | 240,230 | 20g / 리터 |
| 테트라 사이클린 | 시그마 | 268,054 | 12.5 μg / ML 작업 희석 |
| 나트륨 차아 염소 산염 | 모든 브랜드 | 5 % 가정용 표백제 | 신선한 표백제를 사용하십시오. |
| 수산화 나트륨 | 모든 브랜드 | CAS 1310-73-2 | 5 N 주식 |
| M9 배지 | Wormlab 제조법 도서 | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab | 26 |
| levamisol | 시그마 | 31,742 | 100 μm의 - 1 MM 근무 희석 |
| 나트륨 azide | 피셔 과학 | S227 | M9 근무 희석 10 MM |
| 24 잘 플레이트 | Greiner 바이오 원 | 662,160 | VWR 분배기 |
| 현미경 슬라이드 | 모든 브랜드 | 75 X 25 X 1mm | |
| 현미경 커버 전표 | 모든 브랜드 | 22 X 22mm No.1.5 | 현미경 제조 업체에서 권장하는 두께를 사용하십시오. |
| 복합 현미경 | 칼 자이스 혈구 주식 회사 | A1m | 실험의 요구에 맞게 목표 및 필터를 사용하십시오. |
| 미디어 펌프 | Manostat Varistaltic 펌프 | 케이트 모델 # 72-620-000 | 관 그리고 기계에 맞는 설정을 사용 |
참고문헌
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
