방법 논문

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

DOI:

10.3791/3453

⸱

2012년 2월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, Cardiff Institute of Tissue Engineering & Repair, Cardiff University , 2Shandong Qianfoshan Hospital, Shandong University School of Medicine, 3Dermatology and Ophthalmology Research, Institute for Regenerative Cures, University of California at Davis

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을 보여줍니다 생체내 / 전직 생체내에 전류 (DC) 전기 분야 (EFS)를 지시하는 galvanotaxis / electrotaxis 및 기타 세포 반응을 조사하기 위해, 단일 세포 수준에서 촬영된 녹화를 사용합니다.

초록

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내생 전기 분야 (EFS)는 생체내 자연적으로 발생하며 중추 신경계의 1,2의 것을 포함한 조직 / 기관이 개발하고 재생하는 동안 중요한 역할을 재생합니다. 이러한 내생 EFS는 세포와 조직의 전기 저항과 결합 이온 수송의 셀룰러 규정에 의해 생성됩니다. 이것은 적용된 EF 치료는 동물과 인간 3,4의 척수 부상의 기능 복구를 홍보할 수 있다고보고되었습니다. 특히, EF의 감독의 세포 이주는 신경 전구 세포 (NPCs) 7,8 포함한 세포 유형 5,6의 다양한에서 입증되었습니다. 직류 (DC) EFS의 응용은 대부분의 실험실에서 일반적으로 사용 가능한 기법이 아닙니다. 우리는 세포와 조직 문화를 이전 5,11에 직류 EFS의 응용 프로그램에 대한 자세한 절차를 설명했습니다. 여기 2D를 설정하는 계산 필드 강도를 기반 표준 방식의 비디오 데모를 소개합니다NPCs에 대한 D 3D 환경, 그리고 2D에서 단일 세포 성장 조건에서 EF의 자극, 그리고 3D에서 organotypic 척수의 슬라이스에 세포 반응을 조사합니다. 척추 cordslice는 cytoarchitectonic 조직 조직도 이러한 문화 9,10 내에 보존되기 때문에 전직 NPC의 생체내 행동, 사후 이식을 공부하는 데 이상적인받는 조직이다. 또한이 전 생체내 모델은 또한 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 수속을하실 수 있습니다. 그것은 비판적으로 2 차원 환경뿐만 아니라에서 셀 행동을 평가하는 것이 필수적뿐만 아니라 생체내 환경에서 mimicks 3D organotypic 상태입니다. 이 시스템은 수 체외 및 생체내 전직의 단세포 이주의 3D 추적과 조직 또는 장기의 문화에 커버 유리 기반 요리를 사용하고 월이면쪽으로 이동하기 전에 중간 단계가 될 수 고해상도 이미징조종의 패러다임.

프로토콜

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1. 신경 전구 세포 격리

  1. 추운 DMEM/F12 기초 중간에 E14-16 생쥐와 장소에서 전체 뇌를 해부. 35mm 배양 접시에 해부 현미경 및 전송 두뇌 아래의 모든 meninges를 제​​거합니다.
  2. 기계적 조직 파편에 머리를 해리 및 15 ML 관에게 전송하는 미세 집게를 사용하여 다음 파편을 제거하기 위해 3 분 동안 800 rpm으로 샘플을 원심 분리기.
  3. DMEM/F12 포함된 bFGF와 EGF를 추가하고 1 ML의 피펫으로 씹다.
  4. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
  5. 2-5에서 flasks로 플레이트 전지 X 10 4 세포 / ML, 그때 전체 매체가 3 일 통과 세포에게 매 6 일 모든 변경 수행합니다.
  6. 적어도 5 구절 후에 다이제스트 neurospheres 단일 세포에 트립신과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하고 poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic의 챔버 (2 아래에 설명된대로 준비)에서 성장. , N2 - 보충을 포함하는 성장 매체를 사용하여bFGF와 EGF는 항상 NPCs의 속성을 유지합니다.

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토론

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우리가 사용하는 프로토콜은 이전 연구 5,11에 바탕을두고 있습니다. 표준화와 정확한 차원 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 배양해 세포 또는 조각으로 한천 교량, 스테인 버그의 솔루션 및 자세 / AgCl 전극를 통해 EF을 적용하는 동안 이러한 방법을 사용하여 안정적인 문화와 전류 조건이 유지됩니다. 챔버의 깊이는 다른 예제는 11 두께에 대한 수용하도록 조정될 수 있으며, 세포의 경우, 챔버 크기는하지만 많은 세포 (예 : 서양 얼룩 분석은 많은 세포가 필요합니다) 필요한 수용하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 절차를 허용하도록 이러한 방법을 수정하고 개발했습니다. EFS에 대한 세포 반응에 관한 이전 연구의 대부분은, 2D 환경에서 실시되었습니다. 단일 세포 수준에서 NPCs의 electrotactic 응답의 생체내 연구어떤 생리적 관련성을 .......

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공개 사항

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우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

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이 작품은 왕립 학회 URF 부여 UF051616, 영국 및 BS에 대한 유럽 연구 협의회 StG 보조금 243,261에 의해 지원되었다. MZ 연구실의 작업은 또한 재생 의료 보조금 RB1-01417의 캘리포니아 공과 대학에서 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
FGF-기본적인 재조합 인간 Invitrogen PHG0026 20 NG / ML
EGF 재조합 인간 Invitrogen PHG0311 20 NG / ML
N2 - 보충 (100X) 액체 Invitrogen 02,048
DMEM/F12 매체 (높은 혈당) Invitrogen 31330-095
폴리-D-라이신 Millipore -003-E
자연 마우스 Laminin Invitrogen 23017-015
성장 요인은 지하 분리막 매트릭스 (Matrigel)을 감소 BD Biosciences 354,230
HEPES 버퍼 Gibco 15,630
McIlwain 조직 헬기 Mickle 연구소 엔지니어링 주식 회사 TC752-PD
다우 코닝 높은 진공 실리콘 그리스 시그마 - 올드 리치 Z273554

참고문헌

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  1. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
  2. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
  3. B....

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