본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을 설명합니다 Saccharomyces cerevisiae. 이러한 프로토콜은 쉽게 효모의 다른 misfolded 단백질의 독성을 모니터링하기 위해 수정할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 misfolding 같은 알츠하이머 질환, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병과 한 많은 인간의 질병, 특히 neurodegenerative 질병과 연관됩니다. 헌팅턴의 질병 (HD)은 단백질 huntingtin 이내 polyglutamine (polyQ) 지역의 비정상적인 확대로 인해 발생합니다. polyQ - 확장된 huntingtin 단백질이 비정상적 형태 (즉, 그것이 misfolds)을 attains 및 세포 독성에게 2를 일으 킵니다. 적어도 8 이상 neurodegenerative 질병은 Spinocerebellar Ataxias과 케네디의 질병 3를 포함해 polyQ - 확장에 의해 발생합니다.
모델 생물 효모는 polyQ - 확장을 표현 polyQ - 독성의 내부와 남북 분자 요인의 영향, 그리고 세포에 손상되는 세포 경로의 식별을 포함하여 polyQ - 독성의 세포 및 분자 기초에 중대한 통찰력을 촉진하고있다 단백질 3-8. 중요단조는 효모에서 발견된 polyQ - 독성의 여러 측면 따라서 polyQ - 독성 underpinning 기본적인 메커니즘의 발견을위한 효모 모델의 중요성을 보여주는 다른 실험적인 시스템에서와 HD 환자에서 샘플에 어느 정도까지 재현했다.
효모에 polyQ - 독성을 결정하는 직접적이고 비교적 간단한 방법 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장 결함을 측정하는 것입니다. 본 원고는 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 성장을 측정하여 효모에 polyQ - 독성을 결정하는 세 보완 실험적인 접근 방법을 설명합니다. 처음 두 실험 방법은 접시에 효모의 성장을 모니터링, 세 번째 접근법은 BioscreenC 악기를 사용하여 액체 효모 문화의 성장을 모니터링합니다.
또한이 원고는 효모 polyQ 모델을 다룰 때 발생할 수있는 실험적인 어려움을 설명하고 또는 피하기 위해 도움이 될 전략을 보여줍니다이러한 어려움을 최소화합니다. 여기에 설명된 프로토콜 식별 및 유전 경로 및 polyQ - 독성을 조절 작은 분자를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 설명 assays는 효모 모델의 다른 질병 관련 misfolded 단백질에 의한 독성의 정확한 분석을위한 템플릿으로 사용될 수 있습니다.
프로토콜
1. 효모의 독성 PolyQ - 확장 단백질의 표현
체계적인 분석은 효모 7 독성을 생산하는 데 필요한 polyQ - 확장 단백질의 정확한 아미노산 서열을 확립했습니다. 이 독성 polyQ - 확장 단백질 그림을 참조 huntingtin 단백질, polyQ 지역 및 카르복시 - 터미널 융합의 원래 순서에서 형광 단백질 (GFP 또는 CFP 중 17 아미노산 뒤에 아미노 터미널 깃발 태그가 있습니다 1). inducible와 상대 강한 GAL1 발기인 7, 9의 통제하에 표현하면 46 glutamines 이상의 polyQ 확장과 단백질의 표정은 (72과 103 glutamines를 예) 효모의 독성을 생산하고 있습니다.
이전에 설명한 바와 같이, 효모의 polyQ의 독성는 prion의 형태로 단백질 Rnq1p 가지고 세포에만 없었던 이유는, [RNQ +], 예를 들어 효모 변형 W303 9. 독성 polyQ - 확장 단백질 R이러한 polyQ 길이 종속적인 독성 (아래 참조)과 집계 (그림 1 B)와 같은 효모에 polyQ - 생물학 ecapitulates 중앙 측면. 특히, 독성 polyQ - 확장 단백질은 즉시 효모 세포를 죽이....
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토론
본 원고는 독성 polyQ - 확장 단백질을 표현 효모 세포의 감소 성장을 바탕으로 모델 유기체 효모에 polyQ - 독성을 측정하는 세 보완적인 실험 방법을 설명합니다. 효모의 작업 polyQ - 확장 단백질 9,11,12의 misfolding과 독성을 포함한 단백질 misfolding의 기본 세포와 분자 메커니즘과 그 다음의 독성,로 심오한 통찰력을 제공하고있다. 여기에 제시된 프로토콜을 기반으로 실험은 이미 polyQ 독성 5-8,13,14을 underpinning 유전 강화하거나 진압 polyQ의 독성의, polyQ의 독성의 작은 분자 조절 및 세포 메커니즘을 식별하고 특성을 위해 기여했다.
제시된 프로토콜은 쉽게 이러한 서로 다른 성장 조건이나 중 polyQ 독성을 감소하거나 더욱 심하게하다 유전자 돌연변이와 같은 polyQ의 독성의 다른 수정자를 탐험하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, 제시된 실험 프로토콜쉽게 효모의 다른 유.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
Duennwald 연구소의 작품은 노화 연구 (멀리), 유전성 질병 재단 (HDF)와 윌리엄 우드 재단에 대한 미국 연방의 보조금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 악기의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Frogger (6x8 핀) | V & P 과학, 샌디에고 | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growthcurves 미국 | 5,101,370 | |
| 100 잘 허니컴 접시 | Growthcurves 미국 | 9,602,550 |
참고문헌
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <....
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