내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

요약

여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을 설명 생체내에서. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH)와 피질 microcirculation 동시에 두 개의 광자 이미징을 기반으로합니다. 이 방법은 조직 산소 공급의 고해상도 분석을 위해 유용합니다.

초록

신진 대사 수요가 높은 수준에서 작동하려면 두뇌의 능력은 혈류와 조직 산소 확산을 통해 지속적인 산소 공급에 따라 달라집니다. 여기에 직접 microregional 조직 hypoxia을 시각화하고 마우스 피질에서 perivascular 산소 그라디언트를 추측하는 시각화된 실험 및 방법론 프로토콜을 소개합니다. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH) 내생 형광 강도 및 조직 NADH 형광이 갑자기 10 mmHg ^한 아래의 조직에 산소 수준에서 증가 관찰 조직에서 산소 분압 간의 비선형 관계를 기반으로합니다. 우리는 텍사스 레드 dextran와 대조 내장 NADH 조직 형광 및 혈장의 동시 여기를 허용 740 NM에서 두 광자 여기를 사용합니다. 기존의 접근 방법 이상이 방법의 장점은 다음과 같습니다 그것은 본질적인 조직 신호의 활용 및 생체내 인스턴트 메시지에 표준 두 개의 광자를 사용하여 수행할 수 있습니다장비를 노화, 그것은 ~ 50 μm의 깊이 해상도로보기의 전체 분야에서 지속적인 모니터링을 허용합니다. 우리는 대뇌 혈관에서 멀리 뇌 조직 영역 혈관 산소 공급의 감소에 따라 기능적으로 hypoxic 될 최초 취약한 유역 지역에 해당 보여줍니다. 이 방법은 이미지 microregional 피질 산소에 한 수 있으므로 neurovascular 질환과 뇌졸중의 불충 분한 또는 제한된 조직 산소 공급의 역할을 조사하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 이미징을위한 동물의 준비

참고 : 우리는 성인 c57BL 마우스를 사용합니다. 서로 다른 유전자 변형 종자는 연구 질문에 따라 사용할 수 있습니다. Microvascular 수술 및 펄스 oximetry은 흰색 모피와 생쥐 (예 FVB 스트레인)에 용이합니다.

1. 벤치에서 외과 사이트를 준비합니다. 모든 수술 장비는 70 % 에탄올로 autoclaved하거나 소독해야합니다.
2. 직장 프로브를 삽입하고 지속 절차 전반에 걸쳐 동물의 체온을 측정
3. 처음에 5 % isoflurane을 사용 마우스를 마취. 15-30의에서 동물이 이동하지 않는 경우, 손난로 (37 ° C)에 배치하고, isoflurane 1.3-1.5 %)를 포함하는 공기의 지속적인 제공을위한 얼굴 마스크를 적용합니다. 동물이 통증 자극 (예 : 꼬리 핀치)에 응답하지 않았는지 확인합니다.
4. 건조한 공기에 노출을 막기 위해, 마우스의 시선을 충당하기 위해 인공 눈물 젤을 사용하십시오.
5. 전기 면도기를 사용하여, 헤어 F를 제거롬 머리와 양쪽 허벅지에서. 2 분의 허벅지에 머리 제거제 (예 : 나이르) 적용하고 나머지 머리를 제거 조심스럽게 닦아냅니다. 이 허벅지는 oximetry에 사용됩니다.
6. 10 % povidone-요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독.

2. 열린 두개골 두개골 창 준비하기

1. 두개골에 꼬리 5mm 시작하면 가위로 두피에 절개를하고, 일cm을 부활시켰습니다. 두개골을 노출 언저리 피부를 이동합니다.
2. 두개골 위에 세포막을 제거하기 위해서는 두개골의 맨 10 % 산화철 염화물 솔루션을 적용합니다. 과잉 솔루션을 닦아하고, 45 ° 각도 # 5 핀셋으로 멀리 세포막을 다쳤어요. 그것은 머리에 접시가 안전 (단계 # 4-6) 두개골에 장착할 수 있도록하기 위해 신중하게 사이트를 준비하는 것이 중요합니다.
3. 해부 현미경 사용하여 관심 영역을 식별합니다. 두개골 봉합은 피해야한다합니다 인해 두개골 C다음 행과 함께 예측할하다.
4. 머리 접시의 창 (그림 1)의 가장자리 주위에 빠른 접착제의 얇은 레이어 (예 Locktite 454)을 적용합니다. 관심 지역 창에 노출되는 등의 방법으로 헤드 플레이트를 둡니다. 헤드 접시 빛의 압력을 적용합니다. 급속하게 접착제를 중합하는 치과용 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. 접착제가 polymerizing하는 동안 10 초 동안 잡아.
5. 머리 판과 두개골을 봉인하기 위해 창의 가장자리로 빠른 접착제의 작은 금액을 적용합니다. 절개 범위 하에서 동물의 소유자로 머리 판 치고.
6. 6,000 RPM 및 IRF 005 드릴 비트에서 설정 Microtorque II 드릴을 사용하여 두개골에서와 헤드 플레이트의 모든 여분의 접착제를 제거합니다. 이것이 달리 유리 커버의 부착을 방해하므로 헤드 판에 남아있는 접착제가 제거되어야합니다.
7. 1,000 rpm으로 드릴을 설정하고, 지름 ~ 5 m의 헤드 플레이트 창 내부에 원을 만들어 두개골을 뚫는 시작줄게. 당신은 아주 부드러운 연필로 드로잉하는 것처럼 빛을 전면 움직임을 사용합니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 뚫는 중지합니다.
   참고 : 헤드 플레이트의 구멍의 모양은 원형 두개골 창을 만들 쉽게 드릴 비트 (왼쪽 및 오른쪽 손으로 외과 의사에 대한)에 대한 추가 액세스하실 수 있습니다. 또한, 두 이상한 모양의 구멍은 추가 polarographic 또는 electrophysiological 측정 두개골 창 아래에 뇌 조직으로, 클락 - 전극이나 유리 전극을 삽입하기 위해 필요한 공간을 제공합니다.
8. 시추가 진행되면서 뚫으는 중앙의 손상 두개골 주위에 형성됩니다. thinned 두개골을 통해 찌를하지만, 설령 두께의이 뚫으을하지 않도록주의하십시오. 대형 혈액 혈관 - 그들이 타협하지 않으며, 가능한 경우도 건드리지 않았어야 주위에 여분주의하십시오.
9. 윈도우의 중앙에 ( "탁 끄다") 뼈 올려 핀셋 # 3 중 하나 "다리"를 사용합니다. artific 한 방울을 적용창문에 ial 뇌척수 (aCSF).
10. 부드럽게 부드러운 조직 종이 모서리를 (예 : Kimwipe)를 사용 aCSF를 닦아주십시오. 보통 경질은 창의 가장자리 주위에 하나 이상의 장소에서 손상되었습니다. 이러한 사이트 중 하나에서 시작은 부드럽게 들어올리 다음 45 ° 각도 핀셋 # 5를 사용하여 뇌 표면에서 경질을 제거합니다. 경질을 제거하기 시작하기에서 사이트를 선택하면, 큰 혈관에 인접한 지역을 피하십시오. 출혈이 발생하면 aCSF 한 방울을 적용하고 막을 경미한 출혈에 대해 2-3 분 기다립니다.
11. 0.07 %의 낮은 용융 aCSF에 녹아있는 아가로 오스)이 체온에 녹아 아가로 오스 가져와 준비합니다. 뇌의 표면에서 aCSF의 초과 멀리 닦아주십시오. 윈도우에서 아가로 오스를 붓고, 그리고 유리 슬라이드와 커버. 유리와 헤드 플레이트 사이의 접촉을 만들기 위해 부드럽게 유리를 눌러 아가로 오스는 고체 때까지 10-20 초 정도 기다리십시오.
12. 핀셋과 부드러운 티슈를 사용하여 유리 커버에서 초과 아가로 오스를 제거합니다.
13. 작은 넣고접착제 헤드 판에 유리로 유리 주위 급속한 접착제의 금액입니다. 접착제 (그림 1)을 고체화하기 위해 치과 시멘트의 작은 금액을 적용합니다.

3. 정맥 주사와 혈액 산소 모니터링

참고 : 우리는 일상적으로 정맥 주사 텍사스 적색의 응용보다는 꼬리 정맥에 대한 대퇴 정맥을 사용. 대퇴 정맥 주사는 염료의 안전하고 재현성 bolus 주사를 제공하기 때문입니다.

1. 부분적으로 왼쪽 허벅지 안쪽을 폭로를 통해 동물을 켭니다. 이 자세로 동물을 보호하기 위해 테이프를 사용하십시오.
2. 살균 스크럽 후 피부에 100 % 에탄올을 적용합니다.
3. 무릎에서 치골 symphysis로 내측 허벅지를 따라 절개를합니다. 족집게 # 5를 사용 무딘 절개로 구분 부드러운 조직.
4. 텍사스 레드 (2.5 밀리그램 / ML) 130 μl로 1ml 주사기를 채우십시오. 새로운 바늘 (30 게이지) 첨부하고, 베벨을 유지, 30 °에서 신중하게 그것을 구부. 바늘 WI를 채우일 텍사스 레드 솔루션입니다.
5. 해부 현미경에서 대퇴 정맥에 바늘을 삽입하고 텍사스 레드 100 μl를 주입. 바늘을 제거하고 가볍게 출혈을 멈추게하기 위해 거즈로 정맥을 누르십시오.
6. 4-0 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
7. 혈액 SpO _2의 지속적인 모니터링 (적절한 혈액 산소를 보장하기 위해) 허벅지 (있는 머리는 이전에 제거되었다)에 산소 농도계 프로브를 배치하십시오.

4. 두 광자 이미징

참고 : 여기 소스로 사 레이저 : 우리는 스펙트럼 - 물리 MaiTai HP DeepSee femtosecond 티가있는 올림푸스 Fluoview1000 multiphoton 이미징 시스템 (직립)을 사용합니다. 이미징 들어, × 10 NA 0.45 (자이스 혈구는 C-고차 색지움) 또는 × 25 NA 1.05 (올림푸스 XLPlan N) 물에 침지 목표를 사용합니다. 우리는 512의 해상도 × 픽셀과 512 픽셀 2 μs의 시간을 머물러에서 12 비트 심도에서 이미지를 가져가라. NADH와 텍사스 - 레드-dextran은 동시에 740 nm의에서 흥분하고, 형석있다escence은 이색성 거울 / 니어 IR-차단 필터 조합을 사용하여 여기 빛으로부터 분리합니다 (FF665-Di01을, FF01-680/SP, Semrock, 로체스터, 뉴욕, 미국)이 이색성 거울을 사용하여 두 개의 채널로 나누어 (505DCXRU, 채도 , Rockingham, 버몬트, 미국), 그리고 대역 통과는 (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36) 필터링. 객관적 후 측정된 레이저 파워 레이어 전의 이미지와 레이어 II의 이미징을위한 20-50 MW를위한 10-20 MW했습니다.

1. 현미경 단계에 수술 준비 마우스를 전송합니다. 높은 배율 두 광자 angiographies으로 등록 기준지도로 사용할 4X 확대 명시야 조명을 사용하여 두개골 창 사이트의 초기 그림을 가져가라.
2. × 10 배율을 사용하여 관심 영역을 확대. 피질 층의 관심 분야를 선택 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의). 높은 배율이 원하는 경우 × 25 목표를 사용
3. (Figu 시계열을 기록 시작2) 다시. 우리는 이미지의 품질을 높이기 위해 3-5 프레임의 평균을 사용하는 것이 좋습니다.
4. 동물이 호흡하고있는 공기의 50 %의 N2를 추가하여 hypoxemia를 유도. 이것은 10 % 산소 수준을 가져올 것이다. 산소 농도계 데이터를 모니터링하여 hypoxemia을 확인합니다.
5. hypoxemia (예를 들어, 30 초)를 통해 시계열을 기록 계속하고, 정상 O2 수준은 복원 후.
6. , 검출 측정하고 혈관 주위 hypoxia와 산소를 조직 실린더의 영역을 quantifying하여 산소 분포의 계산에 대한 데이터를 수집합니다.

5. 데이터 처리

1. Krogh 조직 실린더 반경 R. 이것은 혈관의 중심과 높은 NADH의 형광이 감지되는 경계 사이의 거리를 측정하여 (그림 3)을 수동으로 할 수를 결정합니다.
2. 또는 조직 실린더 반경 R의 전산 탐정 독립적인 세미 - 자동 결정 및 중앙 blo를 사용하여보충 형태로 이전 ^1을 설명하고이 프로토콜의 토론 섹션에 요약되어 OD의 선박 R.
3. 오픈 액세스 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어 ImageJ를 사용하여 hypoxia의 영역을 결정합니다. 이렇게하려면 고가 NADH 조직 형광이있는 영역을 측정 후 높은 NADH 강도 영역을 delineates 임계값을 정의, NADH 신호를 사용합니다.

6. 대표 결과

그림 2는 과도 hypoxemia (이 그림의 PDF 버전을위한, 선택한 스틸 이미지가 사용되었습니다) 중에 NADH / 혈관 조영술 이미지의 비디오를 표시합니다. 영감 산소 농도는 3 분 동안 21 %에서 10 % 인하되었다. 실험적으로 유도된 hypoxemia의이 수준은 대뇌 피질에 심한 hypoxia를 유발하기에 충분합니다. Hypoxia는 동맥 혈액 공급에서 멀리 있던 지역에 초기에, NADH 형광의 증가를 가져온다. 날카로운 NADH 조직 참고피질 microcirculation에서 산소 확산의 관찰할 조직 경계를 나타내는 경계. 그림 3의 이미지는 대뇌 혈관 주위의 산소 확산 경계의 지오메 트리를 보여줍니다. 그것은 이전에 ^한 설명한 바와 같이, 이러한 경계에서 실린더 직경 Krogh 추론할 수 있습니다.

그림 1. 이미징 준비 두개골 창에 (A) 마우스. (B) 헤드 플레이트의 치수.

그림 2. 내생 NADH 녹색 형광이 약 50 μm의 pial 표면 아래 두개의 창문을 통해 두 개의 광자 이미징과 시각. 혈관 텍사스 레드 dextran과 시각입니다. 흡입된 공기 중의 산소가 3 분 동안 10 % 감소하고 21% 위해 복원되었습니다. 스케일 바 : 50μm.

그림 3. NADH 형광 경계 기하학. 노란색 테두리는 기능성 hypoxia의 경계를 표시, 파란색 동그라미가 예상 산소 (Krogh) 실린더를 보여줍니다. 블루 라인 실린더 반지름을 보여; 번호는 micrometers의 반지름을 보여줍니다.

토론

산소 확산에 대한 높은 공간적 해상도 정보는 뇌의 혈액 흐름이 뇌 세포에 산소를 제공하고, 신진 대사 수요를 충족하기 위해 규제하는 방법을 이해하는데 중요합니다. 클락 스타일의 유리 전극을 사용하여 전통 polarographic 산소 측정은 고도의 침해이며, 낮은 공간 해상도 ^2-3과 의미 (두 번째 범위) 응답 시간이 있습니다. 지금까지 뇌 조직에 PO _2를 측정하는 유일한 비침습 방법 흥분 프로브의 부패 비율이 산소 농도 ^{4 ~} 비례 phosphorescence 담금질이다. 이 방법은 정확한 산소 농도을 제공하지만, 독자적인 염료와 기술적으로 정교한 phosphorescence 평생 이미징 시스템이 필요합니다. 여기서는 두 flurescence 채널과 표준 두 광자 이미징 시스템에서 수행할 수 간단, 단순한 접근법을 보여준다. 우리의 접근 방식은 내장 세포 신호 ⁵ 활용ND는 대뇌 피질의 microcirculation의 대조적인 시각이 필요합니다. 때문에 기능적으로 산소 농도에게 ¹ 제한에서 NADH 형광의 비선형, 본질적 이진 증가로 인해 고유 NADH 형광은 크게, metabolically 제한 hypoxia와 지역에서 관찰되어 증가했다. 중요한 의미는 대뇌 피질의 microvessels에서 산소 확산의 조직 경계 직접 내생 NADH의 형광 cylindrically 모양의 밀도 변화에 의해 관찰할 수있다는 점이다. 혈관 주위 조직의 산소 볼륨을 정의 cylindrically 모양의 구조의 개념 8 월 Krogh에 의해 소개되었으며, 최근에 실험적으로 두 광자 NADH 이미징 ^1을 사용하여 관찰 되었기 때문에 우리는 Krogh 실린더 이러한 구조를 참조하십시오. Krogh 실린더 이미지는 이미지 프레임의 Z-스택을 복용하여 3 차원으로 수집 할 수 있습니다. 그들은 예리한 arterioles 부근에서 특히 유명하며 그들이 일치하는 기지입니다H는 소진 periarteriolar 조직 실린더의 ^1,4를 모세관.

Krogh 조직 실린더 반경 R의 객관적 결정 (5.2 참조) 우리는 실린더의 중심과 Matlab 함수 "improfile"을 이용하여 바깥 경계 사이의 잘 정의된 세그먼트 내에 방사상 픽셀 강도 값을 측정을 제공한다. 세그먼트의 바깥쪽 경계는 보이는 경계 너머 안전 마진으로 연장하도록 선택되어야한다. 신호 대 잡음 수준을 향상시키려면 우리는 1 ° 단계에서 눈에 띄는 실린더 세그먼트를 충당하기 위해 필요한 모든 요골 대사 averageed. 세그먼트 내의 결과 평균 요골 강도 프로파일 보이는 조직 경계 R에 통신을 가파른 증가를 전시. 우리는 평균 요골 강도 프로필 sigmoidal 기능 (예 : 볼츠만 함수)를 맞게 및 R의 정의로서 반곡점을 (또한 X _{0이라고도} 함) 사용됩니다. 해당하는 두 개의 Photon microangiography (텍사스 빨간색)은 실린더의 중앙에 독방 중앙 혈관의 단면을 공개했다. 중앙 혈관의 지름이 직접 R을 결정하는 데 적용할 수 있습니다.

두 광자 NADH 영상은 피질 microangiography의 동시 고해상도 영상과 동일한 공간 해상도를 제공합니다. 이 방법의 정량 응용 프로그램의 중요한 특징은 P NADH 형광 증가 ₅₀ 3.4 것으로 측정되어있다는 ± 0.6 mm HG ^1과 그것 참 microregional 조직 PO _2의 함수로 NADH 형광 강도는 수학적으로 표현할 수 sigmoidal 기능. . 우리는이 기술 하나 hypoxia (10 %로 공기 중에 산소 함량을 감소하여)에 가장 취약한 뇌 영역을 식별할 수있는 표시됩니다. 우리는 또한 산소 확산은 간단한 기하학적인 perivascular 패턴을 따르는 것으로 나타났습니다.

하나 crit이 방법에 대한 ICAL 단계는 두개골 창 준비의 품질입니다. 수술은 노출된 지역으로 혈액 흐름을 방해하지 위해서는 최소한의 손상을 생산한다. 우려가 수술 손상 준비, 창 아래에있는 피질 어떤 의미있는 실험을 precluding,로 시작하는 hypoxic있을 수있다는 것입니다. 잘 준비된 두개골 창에서 모든 선박 유형의 생생한 혈액 흐름과 가장자리를 따라 노 상당한 출혈 상태로 그대로 전공 및 부전공 혈관이 있어야합니다. normoxic 조건에서 (PaO2 80-100 mmHg, SP O2 97-99%) 뇌 실질 조직이 높긴하지만 NADH의 형광과 눈에 밝은 조직 패치없이 균일 균질 NADH의 형광을 전시한다.

우리의 접근 방식의 근본적인 물리적인 제약이 깊이 침투가 제한됩니다. 뇌 속의 청록색 NADH의 형광은 이러한 파장의 헤모글로빈 흡수 및 조직 비산에 의해 급속하게 감쇠됩니다. 비록 높은 수치 조리개와 (예 : 1.05) 물침지 목표는 두 광자 NADH 이미징은 현재 피질 층 I 및 II로 제한됩니다. 또는 흰색 물질에 근접 에너지 대사 가능성이 회백질 다를 수 있기 때문에이 제한은 과학적으로 적합합니다. 그러나 이러한 레이어 IV-VI 또는 흰색 물질 책자 또는 striatum 같은 subcortical 구조로 깊이 피질 구조의 조사는 생체내 ⁶ 마우스 피질에서 설명한 특수 microlenses의 사용을 요구한다.

이러한 기능적인 충혈 및 모세관 유동 속도의 검출 ⁷ 분석과 같은 다른 측정과 결합하면 산소 확산 경계 NADH 기반의 측정은 특히 유용할 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 뇌졸중과 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 hypoxia를 시각적으로 적응 할 수 있습니다. 산소 확산의 간단한 기하학 하나는 모세관 밀도 드이다 상황에서 microvascular 침대에서 산소 그라디언트를 예측할 수⁸ (예 : AD ⁹⁾ 주름잡은 감소 모세관 밀도가 뇌 세포 영역이 microstrokes에 의한 hypoxia 손해에 대한 증가 위험이 있는지 살펴보아야한다. 조직 hypoxia와 후속의 연결을 사망 또는 모세관 리모델링 ^{10 ~} 이미지 능력 microregionally 또한 한 조직 microstrokes의 형상과 크기를 검사하여 hypoxia가 발생하는 조직의 볼륨을 확인할 수 있습니다뿐만 아니라 관계.

내생 NADH의 형광의 증가는 급성 mitochondrial 부전의 직접적인 결과이기 때문에 마지막으로,이 방법은 신경 에너지 대사 ¹¹ mitochondrial 부전 프록시에 대한 특정 기자로 NADH 이미징을 사용할 수있는 기회를 만듭니다.

결론적으로 내생 NADH 형광의 2 광자 영상 모두 정상 아래의 두뇌에 산소 공급과 소비를 이해하는 데 사용할 수있는 간단하고 undemanding 도구입니다그리고 pathologic 상태 인치

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
가열 패드	Bodi 히트 너머
안과 연고 (인공 눈물)	화이자
Povidone-요오드 10 % 용액	Betadine
산화철 염화물 10 % 용액
시멘트	회사 Stoelting	51,456
Cyanoacrylate 454	Loctite
aCSF	하버드 장치	597,316
Microtorque II handpiece 키트	피어슨	R14-0002
IRF 007 드릴 비트	파인 과학 도구	19008-07
집게 # 5	파인 과학 도구	11,295
집게 # 45분의 5	파인 과학 도구	11251-35
# 0 유리 coverslip	전자 현미경 과학	63750-01
Photomultiplier 관	하마 마츠	HC125-02
티 : 사파이어 레이저 마이 - 타이	스펙트럼 - 물리	및nbsp;