우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.
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방법 논문
게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출
이 논문에서
요약
초록
우리는 생체내 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 BiFC 기술을 개발했습니다. 이 두 아닌 중복 조각으로 분할 노란색 형광 단백질 (YFP를)에 의해 수행됩니다. 각 조각은 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 이러한 구성은 다음 융합 단백질의 통과 식을 수 있도록 Agrobacterium의 중재 변환을 통해 Nicotiana benthamiana에 공동 변형하실 수 있습니다. 심리 단백질은 1-7을 상호 작용을 때 YFP 신호의 reconstitution에만 발생합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하고 유효성을 검사하려면 BiFC는 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 Y2H에서 간과된 수있는 간접적인 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 게이트웨이 기술에 관심 셔틀의 유전자를 (GOI)에 연구자 수있는 범용 플랫폼입니다 많은 표현 가능한 8,9와 같은 기능 분석 시스템과 같은. 오리 엔테이션 및 읽기 프레임 모두 표현 가능한 클론을 만들기 위해 제한 효소 또는 결합을 사용하지 않고 유지하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 실험을 통해 일관성있는 결과를 보장하기 위해 모든 다시 시퀀싱 단계를 제거할 수 있습니다. 우리는 BiFC와 Y2H 모두 assays 10을 수행하기 위해 사용하기 쉬운 도구를 통해 연구자를 제공 게이트웨이 호환 BiFC 및 Y2H 벡터 일련의를 만들었습니다. 여기, 우리는 N.에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BiFC 시스템을 사용의 용이성을 보여주 benthamiana 식물.
프로토콜
1. Agrobacterium 문화의 준비
- Agrobacterium 긴장 GV3101은 이전에 게이트웨이와 호환 BiFC 벡터 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN, 융합 GOI의 구조가 포함된 각 변형.
- BiFC 융합 단백질의 5 ML YEB (5g L -1 쇠고기 추출물, 1g L -1 효모 추출물, 5g L -1 펩톤, 5g L -1 자당, 2mM MgSO 4, 산도 7.2) 문화를 예방하기와 agrobacterium 변형 구성 적절한 항생제 선택합니다. 28 야간 문화를 성장 ° C 200 rpm으로 흔들어.
- 멸균 1.5 ML의 원심 관에 문화 1 ML를 제거합니다.
- 상온에서 10 분 1,000g에서 펠릿 세포가 뜨는 폐기.
- 침투 미디어 1 ML (5g L -1 D - 글루코오스, 50 MM MES (시그마), 2 MM 나 3 PO 4, 0.1 MM acetosyringone) 11을 추가하여 펠렛을 씻으십시오. pipetting하여 ....
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토론
BiFC 분석은 단백질 상호 작용을 공부를위한 강력한 도구입니다. 전통 Y2H 분석과는 달리, BiFC뿐만 아니라 단백질 단백질 상호 작용의 시각화을 허용뿐만 아니라 하위 세포 지방화 같은 단백질 복잡한 더 많은 정보를 제공합니다. 또한, 그것은 두 후보 단백질이 세번째 파트너 가까이에 충분히 가져 수있는만큼 간접적인 상호 작용을 검출하는 것이 가능합니다. 모든 기술과 마찬가지로, BiFC는 제한 사항이 있습니다. 형광단 형성에 대한 분자 산소의 요구로 인해, BiFC은 산소의 존재에서 살아남기 수없는 의무를 anaerobes에서 사용할 수 없습니다. 이것은 에어로빅 생물 6 BiFC의 사용을 제한합니다. 형광단 단지의 형성은 되돌릴 수 있습니다. 이것은 다른 사람과 상호 작용하는 단백질을 방지하고 동적인 평형 6 단백질 단지의 협회와 disassociation를 중단 있습니다. 그러나,이 비가 역성은 약하거나 교통 상호 작용을 시각화하는 데 수 있습니다. 형광 단백질 조각들은 융합 아르.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 원고와 일반적인 실험실 지원을 읽을 바이올렛 Nguyen 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토시링곤(Acetosyringone) | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES 수화물(MES hydrate) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL 슬립 팁 투베르쿨린 주사기(slip-tip tuberculin syringe) | BD Biosciences | 309602 |
참고문헌
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging as....
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재인쇄 및 허가
