방법 논문

세포 Refolding 분석

DOI:

10.3791/3540

⸱

2012년 1월 24일

 , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

초록

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이 프로토콜은 셀 기반 시스템 및 억제 / 자극 활동 화합물의 가능한 영향의 분자 보호자의 효소 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 분자 보호자는 1 접는 단백질의 조절에 관여 단백질이며 열충격 2, 영양 기아와 화학 물질 / 독극물 3 노출과 같은 스트레스를 모욕시 세포 생존을 증진에 중요한 역할을했습니다. 이러한 이유로 보호자는 종양이 개발, 암 세포 4 chemioresistance뿐만 아니라 neurodegeneration 5와 같은 행사에 참여하기 위해 볼 수 있습니다. 이러한 효소의 활동을 억제하거나 자극하는 작은 분자 수있는 디자인 따라서 암 치료 7 neurodegenerative 장애 9 가장 공부 전략 중 하나입니다. 여기에서 설명한 분석은 특정 분자 보호자의 refolding 활동을 측정하고 광고의 효과를 연구하기위한 가능성을 제공합니다그 활동 ounds. 이 방법에서는 조사 분자 보호자의 유전자는 반딧불 루시페라제 유전자에 대한 발현 벡터 인코딩과 함께 transfected이다. 그것은 이미 denaturated 반딧불 루시페라제이 분자 보호자 10,11으로 refolded 수 있습니다 설명했습니다. transfection 제어를 정규화로 renilla 루시페라제 유전자에 대한 벡터 인코딩 transfected이다. 이 프로토콜에 설명된 모든 transfections는 HEK - 293 세포에서 X - treme 진 11 (Roche는)로 수행됩니다. 첫 번째 단계에서 단백질 합성은 cycloheximide와 세포를 치료에 의해 저해됩니다. 이후 전개 단백질은 30 분 동안 45 ° C에서 열 충격에 의해 유발됩니다. 37 복구시 ° C는 단백질이 다시 접혀들의 적극적인 형태로와 반딧불의 루시페라제의 활동이 읽기 - 아웃로 사용됩니다 더욱 빛이 생산되고, 더 많은 단백질이 원래의 형태를 다시 놓이게됩니다. 비 열 충격 전지 참조 (refolded 100 %로 설정됩니다루시페라제).

프로토콜

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1. 세포를 심는

  1. 시작하기 전에, 37에서 물을 욕조에있는 문화 매체, PBS 1X와 트립신을 따뜻하게 ˚ C
  2. 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 매체를 기음.
  3. 부드럽게 그들을 씻어 세포에 PBS 1X의 5 ML을 적용합니다.
  4. PBS 1X를 기음과 트립신은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0,025퍼센트를 포함하는 1 ML을 적용합니다.
  5. 부드럽게 트립신의 균등을 접시를 회전.
  6. 37 인큐베이터에있는 세포를 장소 ˚ C 50-10분에 대한 (세포 종류에 따라). 시간 체크인 시간부터 세포 판을 흔들어으로 분리하는 경우.
  7. 매체의 10-20 ML에있는 세포를 Resuspend하고 50 ML 팔콘 튜브에서 그들을 수집합니다.
  8. 베크 만 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 세포의 숫자는 약 60~70%의 합류를 위해 충분해야합니다.
  9. 플레이트 세포를 및 6~8시간위한 씨앗에게 있습니다.

2. 트랜스fection

  1. 이전 transfection하기 ˚ C. 37 물이 욕조에서 혈청 무료 매체의 나누어지는을 따뜻하게
  2. 상온에 X - treme 진 ....

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토론

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이 작품에서는 분자 보호자의 세포내 refolding 활동을 측정하는 프로토콜이 제공됩니다. 그림의 개요에 의해 그림과 같이 전체 분석은 3-4일에서 수행할 수 있습니다. 1.

반딧불과 renilla 루시페라제에 의해 만들어진 빛의 신호의 견고하고 선형이 프로토콜의 재현성위한 견고한 기반을 나타냅니다.

분석의 중요한 단계는 분자 보호자와 반딧불의 루시페라제의 overexpression을 보장하기 위해 효율적인 transfection 시약의 선택입니다. 리포터 유전자는 adenoviral 감염 12 electroporation과 같은 다른 방법 또한 제공 수 있습니다. 반딧불의 루시페라제의 유전자가 안정 transfected있는 동안 또 다른 가능성은, 보호자의 표현 (테트라 사이클린 - 응답 발기인 예를 들어) 13 화학적 i.......

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다닐 Maddalo 기술의 카를 스루에 연구소에서 젊은 탐정 그룹 (YIG)와 같은 연구 활동의받는 사람입니다.

....

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재료

본 실험에서는 Luminometer 양식 Perkin 엘머 '1420 발광 카운터 '벡터 라이트'가 사용되었다

Luminometer를위한 프로그램 :

Renilla : 펌프 1, 100 μl 주입

반응 버퍼 : Pump1, 70 μl 주입

Luciferin : Pump2, 30μl 주입

버퍼는 두 번 증류수에서 이러한 재고 솔루션을 준비 경우 :

  • - 1M MgSO 4 : 일리터에서 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O
  • - 0,5 M EGTA : 일리터에서 190,18 g EGTA
  • - 1M KH 2 PO 4 : 일리터에서 136,09 g KH 2 PO 4
  • - 1M K2 HPO 4 : 228,23 g K 2 HPO 일리터 4 * 3H 2 O
  • - 5M NaCl : 일리터에서 292,2 g NaCl
  • - 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 일리터에서 186,12 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) * 2 시간 2 O  

GLY - GLY 버퍼 :

  • - 25mM Glycylglycin
  • - 15mM MgSO 4
  • - 4mm짜리 EGTA

에 대한 Glycylglycin의 1리터 사용 3,3 g, MgSO4 1M 솔루션과 0,5 M EGTA 솔루션의 8ml의 15ml. 물에 해결, 7,8로 산도를 조정 1 리터의 총 볼륨에 가져와.

Renilla / Coelenterazine 버퍼에 대한 반응 완충액 :

  • - & NBSP, 13,4 MM KH 2 PO 4
  • - 86,6 MM KH 2 PO 4
  • - 0,5 M NaCl
  • - 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)

1M KH 2 PO 4 용액의 1리터 사용 13,4 ML 들어, 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 5M NaCl 솔루션과 2ml의 100ml 1M K 2 HPO 4 용액의 86,6 ML.

회사 카탈로그 / 제품 수량 :
DMEM (Dulbecco의 수정된 이글 중간 1X) GIBCO 41966029
태아 소 혈청 골드 PAA A15 - 151
X - treme 진 구
DNA의 Transfection 시약 		호슈 06365809001
PBS
Dulbecco의 인산은 식염수 1X를 버퍼 		GIBCO 14190-094
맙스
3 - (N - Morpholino) Propanesulfonic 산성 		시그마 - 올드 리치 M1254
Cycloheximide 시그마 - 올드 리치 C7698
수동적 용해 완충액 5 배 Promega E194A

Glycylglycin
EGTA
MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O)

시그마 - 올드 리치
로스
로스 		G7278
3054.2
P027.1

KH 2 PO 4
K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O)
NaCl
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)

로스
로스
로스
로스 		3904.1
6878.2
3957.1
8043.1
Luciferin 반딧불 Biosynth L8200
Coelenterazine Biosynth C7000
DTT (Dithiothreitol) 로스 6908.2
ATP (아데노신 Triphosphate) 호슈 10519987001

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
  2. Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
  3. Hendrick, J. P., Hartl, F. U.

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재인쇄 및 허가

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태그

Intracellular Refolding AssayMolecular Chaperone ActivityLuciferase Reporter SystemHeat Shock RecoveryProtein Refolding MeasurementHEK 293 Cell TransfectionCycloheximide TreatmentFirefly Luciferase AssayRenilla Luciferase ControlX treme Gene Reagent

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