배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.
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방법 논문
배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
배아 세포 이식 1994 1,2의 펜실베니아 대학에서 박사 랄프 Brinster 및 동료에 의해 개발되었다. 이러한 지상 최신 연구받는 동물이별로 공여자 - 파생 spermatogenesis과 정자 생산에 불임받는 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 비옥한 공여 마우스의 배아 세포의 microinjection을 보여주었다. 받는 동물 1 자손에 기증 haplotype의 기증자 - 파생 spermatogenesis 및 전송의 세균성 β-갈락토 유전자 허용 신분증을 들고 기증자 남성의 사용. 놀랍게도, 정액을 운반하는 tubules의 루멘으로 이식 후 이식된 배아 세포 spermatogonia가 3 위치한 지하 막에 luminal 구획에서 이동할 수있었습니다. 이것은 일반적으로 오직 SSCs가받는 testis에서 틈새 시장과 재연결 spermatogenesis를 식민지 수있는 것으로 인정된다. 따라서 배아 세포이식은 testis에서 줄기 세포 틈새 시장을 연구하고 putative spermatogonial 줄기 세포를 특성화하기 위해 기능적 접근 방식을 제공합니다. 지금까지 배아 세포 이식은, 기본적인 줄기 세포 생물학을 명료하게하다하기 전에 이식 4,5에 배아 세포의 유전자 조작을 통해 형질 전환 동물을 생산, Sertoli 세포 - 배아 세포 상호 작용 6,7, SSC 유도하고 식민지 3 공부하는 데 사용됩니다 8,뿐만 아니라 SSC 자기 갱신과 차별화 9,10.
배아 세포 이식은 큰 종 11도 가능한 것입니다. 이들의 주요 응용 프로그램은 다산의 보존, 동물 집단의 엘리트 유전학의 보급, 그리고이 기술 spermatogenesis과 SSC 생물학 연구 logistically 설치류보다 더 어렵고 비싼 등 유전자 변형 동물의 세대입니다. colonizat의 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 큰 수종으로부터 배아 세포의 이식공여 세포 spermatogonial 확장 이온 아니지만 phylogenetically 먼 종 12에서 배아 세포로받는 체세포 구획의 비호 환성으로 아마도 인해 전체 차별화 인치 대안적인 접근은 그들 주변의 체세포의 구획과 함께 대형 종의 배아 세포의 이식입니다. 우리가 먼저 immunodeficient 생쥐의 지느러미 피부 밑에 이식 미숙한 남성의 testis 조직의 작은 조각이 기름지게 관할 정자 13 생산과 전체 개발을 생존하고 받아야 할 수있는 것으로, 2002 년 보도했다. 이후 xenografting testis 조직은 많은 종의에서 성공을 보여줘왔다와 생쥐 14 대형 동물의 testis 개발과 spermatogenesis을 공부하는 귀중한 대안으로 나타났다.
프로토콜
생쥐에 참여하기 A. 배아 세포 이식
1. 받는 생쥐의 작성
- 수신자 기증 testis 세포에 (중 유전적으로 기증자 또는 면역 - 결함과 일치) immunologically 허용해야합니다.
- 받는 사람도 자연스럽게 spermatogenesis의 결여된 (예, W / W V 쥐)이나 내생 배아 세포 고갈 있어야합니다. 배아 세포 고갈은 조사 또는 Busulfan 같은 chemotherapeutic 약물에 의해 형성될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Busulfan으로받는 생쥐를 준비하는 방법을 설명합니다.
- Busulfan의 IP 주입을 통해 시대의 4-6주에서 수신자를 드셔보세요. Busulfan의 최적 복용량은 변형에 따라 달라지게된다. 일반적으로 사용되는받는 종자에서 40-50 밀리그램 / kg의 복용량은 내생 배아 세포 (예 : 44 누드 마우스에 대한 밀리그램 / kg, 50 밀리그램 / B6/129 F1을받는 사람에 대한 ㎏).를 고갈에 충분하다
- DMSO의 Busulfan 파우더를 해산하고 멸균 증류수의 전술이 동일한 볼륨을 추가4 MG / ML의 최종 농도를 O. Busulfan의 석출을 방지하는 데 사용할 35-40시 ° C에....
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토론
1. 배아 세포 이식
배아 세포 이식은 세포 인구의 spermatogonial 줄기 세포의 존재 (SSCs)의 애매하지 않은 확인하는 유일한 기능 분석을 제공합니다. 오직 SSCs는하고 지하 막에서 SSC의 틈새를 식민지와 기증자 파생 spermatogenesis을 시작할 가정 수 있습니다. 배아 세포 이식은 전례없는 방식으로 SSCs을 연구하고 조작하는 것이 가능했다. 기술은 SSCs 4의 유전자 조작을 통해 형질 전환 동물을 생산하기 위해 사용되고, SSC의 식민지 3,8의 패턴, 효율과 속도론을 명료하게하다하려면, SSC 자기 갱신과 차별화 9,10 조절 신호 전달 경로를 연구하기 위해, 성격 자신의 신분 22,23위한 SSCs의 표면 마커; SSCs 6,7,24위한 틈새 환경을 공부합니다. 또한, 상호 이식은 조사를 채용되었는지 infertilit의 표현형y는 Sertoli .......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자 연구실의 작품은 USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213)에 의해 지원되었다; NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2)와 앨버타 혁신 - 건강 솔루션.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Collagenase (유형 IV) | 시그마 | C5138 | |
| 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | 시그마 | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan 파란색 얼룩 | Invitrogen | 15250-061 | |
| 나일론 메쉬 셀 스트레이너 | BD biosciences | 352340 (40μm) 352350 (70μm) | |
| Busulfan | 시그마 | B2635 | |
| 얇은 벽 유리 모세 혈관 | 세계 정밀 악기 | TW 100-3 | |
| BD intramedic의 plyethylene 튜브 (PE100) | BD | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 실크 봉합사 | Ethicon | 706G | |
| 상처 클립 | BD | 427,631 | |
| Sigmacote | 시그마 | SL2 | |
| X-여자 | 시그마 | B4252 | |
| Ferrocyanide 칼륨 | 시그마 | P9387 | |
| Ferricyanide 칼륨 | 시그마 | P3667 | |
| 마그네슘 염화물 | 시그마 | 208,337 | |
| 나트륨 deoxycholate | 시그마 | D6750 | |
| N, N-Dimethylformamide | 시그마 | D4551 | |
| Igepal CA-630 | 시그마 | 18,896 |
참고문헌
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W.
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재인쇄 및 허가
