우리는 overexpression 또는 shRNA 함유 인간 라모스 B - 세포주에서 어떻게 이러한 세포에 체세포 hypermutation를 측정하는 구성합니다.의 retroviral 또는 lentiviral 감염을 수행하는 방법을 설명합니다
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방법 논문
특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가
이 논문에서
요약
초록
B 세포는 V (D) J 재조합에 의해 생성된 낮은 친화 항체와 그들의 인생을 시작합니다. 그러나 병원체를 감지시, 면역 글로불린 (IG) 유전자의 변수 (V) 지역은 높은 친화 항체 1,2의 결과로, 약 100,000 배 더 체세포 hypermutation (SHM)을 통해 게놈의 나머지 부분보다 변이이다. 또한, 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 특정 병원체에 대한 필요한 면역 반응의 종류에 따라 다른 이펙터 기능을 가진 항체를 생산하고 있습니다. CSR과 SHM 모두 uracils 생산 DNA의 사이 토신 잔류물을 deaminates 활성화 유발 cytidine의 deaminase (AID)에 의해 시작됩니다. 이러한 uracils 결국 돌연변이와 재조합 1-3 이어지는, 복구 경로의 오류가 발생하기 쉬운 형태로 처리됩니다.
SHM와 CSR의 분자 자세한 내용은 우리의 현재 이해가 생쥐의 연구 조합에서 온, 기본 셀, 셀 라인, 세포 - F합 실험. 마우스 모델은 많은 수리 요인 (예 : 엉, Msh2, Msh6, Exo1, 그리고 효소 η) 40-10 위해 중요한 역할을 보여주는 유전자 knockouts있는 황금 표준 남아 있습니다. 그러나, 모든 유전자 녹아웃 연구에 대한 의무가 있습니다. 예를 들어, 여러 번 스트랜드 브레이크 수리 단백질의 knockouts는 embryonically 치명거나 B - 세포 개발에 11-14을 손상. 또한, 때로는 SHM 또는 CSR에서 단백질의 특정 기능은 녹아웃으로 인한 더 많은 글로벌 결함에 의해 마스크 수 있습니다. 또한, 마우스의 실험 이후 셀 라인에서 개별 유전자의 표현이 후보 유전자 15-18을 식별하고 특성화하기 위해 점점 더 인기를 첫 번째 단계가되었습니다 변경, 긴 수 있습니다.
라모스는 - constitutively SHM를 겪습 Burkitt의 림프종 세포 라인 - SHM 18-24 공부를하기 위해 인기있는 세포 라인 모델을하고 있습니다. 라모스 세포 중 하나 장점은 그들이 내장된 편리한 준결승있다는 것입니다SHM의 - 양적 측정합니다. 야생 타입 세포들은 돌연변이, IgM 표현을 때려 눕힌 변이의 일부를 데리러으로 IgM을 표현합니다. 따라서, 형광 - 활성 세포 검사 (FACS)의 IgM 손실을 시금 것은 SHM의 수준에 대한 읽기 밖으로 빠르게 제공합니다. SHM보다 양적 측정은 직접 항체 유전자를 시퀀싱하여 얻을 수 있습니다.
라모스의 세포가 transfect하기가 어렵습니다 때문에, 우리는 각각 overexpression 카세트 또는 짧은 머리 핀의 자형으로 RNA (shRNA) 중 하나를 포함하는 retroviral 또는 lentiviral 구조와 세포를 감염 증가 또는 개별 유전자의 표현을 떠난 이후 안정적인 파생 상품을 생산합니다. 여기, 우리가 라모스 세포를 감염 후 SHM에서 특정 유전자 (그림 1)의 역할을 조사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
프로토콜
1. 준비 샘플 및 세포
- overexpression 또는 shRNA 함유 구성과 retroviral 벡터 pKat2 포장 또는 포장 lentiviral 벡터 pVSV - G, pMDLg / pRRE 및 pRSV - 레브 25.의 DNA (midiprep)의 중간 규모 준비를 수행 각각의 구성 6 μg의 DNA와 pVSV - G, pMDLg / pRRE 각각에 대해 하나 pKat2 4 μg (retroviral 감염의 경우) 또는 1.5 μg의 DNA와 pRSV - 수익 포장 벡터 (lentiviral 감염)을 사용합니다.
- BOSC 23 미디어를 준비합니다. transfection 들어, unamended Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM)뿐만 아니라 완전한 DMEM을 모두 사용합니다. 완전한 DMEM을 만들려면, DMEM의 병 1 %의 HEPES 버퍼, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 - 글루타민 (PGS)와 10 %의 신생아 송아지 혈청 (NCS)를 추가합니다.
- 라모스 미디어를 준비합니다. 감염 단계, RPMI 한병에 1 % HEPES, 1 % PGS,와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 추가하여 RPMI - 1640 배지 (RPMI)을 완료합니다. 단세포 시딩 단계, M에 대한2 일간 전체 RPM....
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토론
마찬가지로 이전에 논의, 항체 다양성을위한 세포주 모델 항체 다변화하는 동안 여러 단계에 영향을 소설 단백질을 식별하는 인기있는 출발점이되고 있습니다. 우리는 여기서 라모스 B - 세포 라인에 노크 다운 또는 overexpress 중 단백질로 바이러스 감염을 사용하는 방법을 제시하고 SHM에 미치는 영향을 검사합니다.
이러한 연구에 대한, 우리는 WT 라모스와 AID 안녕 라모스 세포를 모두 활용합니다. 보조 안녕 세포는 보조 표현식 영향을 미치는 요인을 제외하면서 WT 세포는 타겟팅이나 AID 표현뿐만 아니라 AID 생성 병변의 수리에 관련된 요인을 공부하는 데 사용할 수 있습니다.
그것은 SHM이 처음 IgM + 아르 세포 인구에서 IgM의 손실에 대한 시금으로 여기에 측정, 그 또한 언급해야합니다. 또는 IgM 시작하는 것이 가능하다 -. 세.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
pMSCV - AID - I - Thy1.1과 pKat2 벡터는 DG Schatz와 pVSV - G, pRSV - 레브의 종류 선물했고, pMDLg / pRRE 벡터는 BR 컬른에서 어떤 선물했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
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참고문헌
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- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U.
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