13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
미생물이 생화학 및 기능 유전체학 방법을 사용하여 조사 수있는 복잡한 신진 대사 경로를했습니다. 셀 중앙 신진 대사를 검토하고 새로운 효소를 발견하는 한 가지 중요한 기술은 13 C를 이용한 대사 분석 1입니다. 이 기술은 미생물이 13 C 라벨 기판과 먹이 아르 의하여 isotopic 라벨에 따라 달라집니다. 생화학 네트워크의 metabolites 사이의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 우리는 기능 경로를 결정하고 새로운 효소를 발견하실 수 있습니다.
transcriptomics 및 proteomics에 대한 보완 방법, 대사 경로의 isotopomer를 이용한 분석을위한 접근 방식은 세 가지 주요 단계 2를 포함하는으로. 첫째, 13 C 표시된 기판과 세포를 성장. 이 단계에서 매체와 라벨 기판의 선택의 구성은 두 가지 핵심 요소가됩니다. 영양 보충제가 아닌 레이블 탄소의 측정 잡음을 방지하려면, 단독 탄소 소스와 최소한의 매체가 필요합니다. 또한, 레이블 기판의 선택은 그것이 분석되는 경로를 명료하게하다하는 방법을 효과적으로 기반으로합니다. 소설 효소는 종종 일반적인 다른 반응 입체 또는 중간 제품을 포함하기 때문에 단독으로 표시된 탄소 기판이 소설 경로 3, 4의 검출에 대한 균일하게 표시된 것보다 소설 경로의 탐지에 대한 더 정보를 제공하고 있습니다. 둘째, 우리는 GC를 사용하여 아미노산 라벨 패턴을 분석 - MS. 아미노산은 단백질이 풍부하고 따라서 바이오 매스 가수 분해로부터 얻을 수 있습니다. 아미노산은 GC 분리하기 전에 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS)에 의해 derivatized 수 있습니다. TBDMS derivatized 아미노산은 MS와 조각의 다양한 배열의 결과에 의해 조각난 수 있습니다. 조각과 조각 화되지 않은 아미노산의 요금 (M / Z) 비율 질량에 따라, 우리가 중앙 metabolites의 가능한 표시 패턴을 추론할 수아미노산의 엽 성의 전구 물질. 셋째, 우리는이 경로가 활성 2아르 여부를 확인 isotopomer 데이터를 기반으로 제안된 경로의 13C 탄소 전환을 추적합니다. 아미노산의 측정은 중앙 신진 대사에 8 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공합니다. 이러한 대사 주요 노드는 관련 중앙 통로의 기능을 반영하실 수 있습니다.
proteinogenic 아미노산을 통해 13 C를 이용한 대사 분석 널리 저조한 특징 미생물 대사 1 특성화 기능에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 새로운 효소 기능을 발견하기위한 표시된 탄소 기판의 사용을 설명하기 위해 모델 변형으로 Cyanothece 51142을 사용합니다.
프로토콜
1. 세포 배양 (그림 1)
- 미량 원소, 소금, 비타민 및 경로 조사에 가장 구체적으로 표시 탄소 기판과 최소한의 매체 세포를 성장. 세포 배양에 대한 흔들림 flasks 또는 bioreactors 중 하나를 사용하십시오. 이러한 효모 추출물로 유기 영양분은 아미노산 라벨의 측정을 방해할 수 있으며 따라서 문화 매체에있는 수 없습니다.
- UV / VIS 분광 광도계와 함께 최적의 파장 (예 : 51,142 Cyanothece에 대한 OD 730)에서 문화의 광학 밀도에 의한 세포 성장을 모니터링합니다.
- 세포가 처음이 아닌 표시 매체 성장하실 수 있습니다. 중간 로그 성장 위상 세포는 레이블 매체 접종 (볼륨 접종 비율을 3 % (V / V))에 사용 선호하고 있습니다. 표시된 문화는 초기 inoculum 이외의 레이블 탄소의 도입을 피하기 위해 같은 표시된 매체 (3 % V / V 접종 비율) 하위 교양하여야한다.
- 원심 분리 (10 분, 8,000 × g)하여 중간 로그 성장 단계에서 수확 하위 교양 전지 (10mL).
- 6M HCL의 1.5mL의 펠렛을 Resuspend하고 맑은 유리,....
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토론
이 프로토콜은 표시 기판으로 세포를 먹이 및 GC - MS를 통해 아미노산의 결과 isotopic 라벨 패턴을 측정 구성되어 있습니다. MS 데이터 (M / Z 비율)는 MS 이온의 라벨의 단지 전체 금액을주고 있기 때문에, 우리는 M / Z 두 조각 화되지 않은 (M - 57) +의 비율과 조각 아미노산을 조사하여 아미노산의 isotopomer의 배포판을 평가해야 (즉, (M - 159) +과 (f302) +). 또한, 우리는 화학적으로 동일한 매체하지만 다른 라벨 패턴 (분류 1 일 위치, 라벨 2 차 위치 등)이 기판 여러 셀 문화를 수행할 수 있습니다. 이 실험에서 metabolites에 대한 레이블 정보는 중앙 신진 대사 경로를 통해 실제 탄소 전이 경로를 디코딩 통합될 수 있습니다.
경로 분석을 위해, 레이블 기판의 선택이 중요합니다. 일반적으로 단독으로 표시된 탄소 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 NSF 커리어 그랜트 (MCB0954016)와 DOE Bioenergy 연구 부여 (DEFG0208ER64694)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| TBDMS | 시그마 - 올드 리치 | 19,915 | - |
| THF | 시그마 - 올드 리치 | 34,865 | - |
| 표시된 탄소 기판 | 캠브리지 동위 원소 연구소 | 실험 요구 사항에 따라 달라집니다 | 웹사이트 : http://www.isotope.com |
| 기체 크로마토 그래프 | 애질런트 테크놀로지 | 휴렛 팩커드, 모델 7890A | - |
| GC 열 | J & W 과학, Folsom, CA | DB5 (30m) | - |
| 질량 분석계 | 애질런트 테크놀로지 | 5975C | - |
| Reacti - Vap Evaporator | 써모 과학 | TS - 18825 | 아미노산 샘플을 건조 |
참고문헌
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev
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재인쇄 및 허가
