시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Summary

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

Abstract

세포 이주는 배아 개발, 조직 복구, 면역 체계 기능, 그리고 종양 침공 ^{1, 2를} 위해 중요하다 역동적인 과정이다. 방향 마이 그 레이션하는 동안 세포는 세포외 chemotactic 신호에 대응하거나, 기본적인 운동성 기계에서 제공하는 본질적인 단서 ³ 응답으로 급속하게 이동합니다. 세포는 세포가 자신의 로컬 환경을 탐험 있도록 낮은 본질적인 방향성을 가지고하면 랜덤 마이 그 레이션이 발생합니다.

세포 이주는 초기 응답 세포에서 복잡한 과정이다 분극을 거쳐 및 마이 그 레이션 ^2의 방향으로 라고나을 확장합니다. 이러한 Boyden 챔버 마이 그 레이션 분석과 같은 마이 그 레이션을 측정하는 전통적인 방법은 끝점 결과로 마이 그 레이션을 측정하는 수 체외에서 chemotaxis를 측정하기위한 쉬운 방법입니다. 그러나,이 접근법은 역시 개별적인 마이 그 레이션 매개 변수의 측정을 허용하지 않으며 그것은 visua 수 있습니까세포가 마이 그 레이션하는 동안 겪습하는 형태학의 변경 lization.

저속 현미경 - 여기, 우리는 비디오를 사용하여 실시간으로 이주하는 세포를 관찰 할 수 있습니다 방법을 제시한다. 세포 이주와 침략이 암의 특징이기 때문에이 방법은 체외에서 암 세포 이주와 침략을 연구에 적용 될 것입니다. 혈소판의 무작위 마이 그 레이션은 혈소판 기능 ^4의 매개 변수 중 하나로서 간주되었으며, 따라서이 방법은 또한 혈소판 기능을 공부에 많은 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 신속하고 안정적​​인 재현성 적의를 가지고 있으며, 세포 숫자의 최적화가 필요하지 않습니다. 세포 생리학을위한 적합한 조건을 유지하기 위해서는 현미경이 CO ₂ 공급 및 온도 자동 온도 조절 장치를 갖추고 있습니다. 세포 운동은 정기적으로 현미경에 장착 카메라를 사용하여 사진을 찍고 의해 모니터링된다. 세포 이주는 측정 평균 속도로 계산할 수Slidebook 소프트웨어에 의해 계산됩니다 verage 변위.

Protocol

1. 접시의 준비는 콜라겐으로 코팅

1. 10 μg / Opti-가상 미디어 ML의 최종 농도로 콜라겐을 희석.
2. 1 단계에서 각도에 1.5 ML를 추가하여 콜라겐과 코트 6 잘 접시. 4에서 하룻밤 품어 ° C.
3. 다음 날, 1X 인산 2 번 식염수 (PBS)를 버퍼 접시를 씻고 PBS에 그들을 저장합니다.

2. 6 - 잘 접시에 세포 준비 및 심는

참고 : 세포의 움직임을위한 최적의 조건을 보장하기 위해 따뜻한 매체와 PBS를 사용

1. 성장 MDA-MB-231 (침입 유방암 세포주) 띄엄띄엄 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) 인치 이 예제에서, 우리는 MDA-MB-231을 사용하지만,이 방법은 어떤 자기편 종양과 비 종양 세포 라인에 적용할 수 있습니다.
2. 따뜻한 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 trypsinization에 의해 수집합니다. 통화를 만들기 위해 현미경으로 세포를 검사세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분리되는 재.
3. 10% FBS으로 DMEM 배지를 추가하여 세포를 수집, 부드럽게 5 ....

Discussion

실시간으로 무작위로 마이 그 레이션 분석은 속도와 변위와 같은 세포 이주 매개 변수 중 정확하고 민감한, 분석을 가능하게합니다. 이 방법은 포인트 측정 값을 끝낼 국한되지 않고, 따라서 그것은 더 많은 양적입니다. 이후 세포는 혈청과 정상 DMEM 배지에서 모니터링되며 그것은 혈청 무료 미디어 이상 인큐베이션의 해로운 효과를 감소시킵니다. 이것은 세포 마이 그 레이션이 서식하기 때문에이 방법은 이전에 다른 substrata의 효과를 연구하는 데 사용할 수있는 하층 ^8로 세포 연락처를 위반에 의존하는 것으로 나타났습니다.

중요한 단계 중 하나는 최적의 마이 그 레이션을 보장하기 위해 37 5 % ° C와 CO _2로 온도의 적절한 통제를 포함한다. 분석은 원하는 시간 지점에서 철새 반응을 모니터링하기 위해 유연성을 허용하지만, 그것은 시간 포인트의 수를 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 마이 그 레이션 속도를 갖는 일부 세포가.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	써모 과학	SH30243.01
FBS	제미 나이 바이오 제품	100-106
Opti-가상	Invitrogen	31985-070
콜라겐	BD	354,231
라이브 셀 챔버 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러와 현미경	올림포스 산	올림푸스 1X81
환경 제어 챔버	Neue	Neue 라이브 셀 회의소	와우 챔버의 상단을 통해 적절한 광학 정의 지어진 사각형 유리 플레이트 상단 있습니다. 직사각형 모양의 experimen 많은에 사용되는 멀티 잘 번호판을 수용TS.
자동 XY 스테이지	이전에	이전 Proscan	이것은 정확한 반환 시간 저속 현미경 중에 선택한 XY 위치를 곱하면 수 있습니다.
카메라		하마 마츠 EM 카메라 C9100
소프트웨어	일반적으로 이러한 올림푸스 현미경 같은 공급 업체를 통해 구입	슬라이드 도서 5