방법 논문

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

DOI:

10.3791/3585

⸱

2012년 5월 13일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, LSU School of Medicine, 2Department of Oral Biology, LSU School of Dentistry, 3Stanley S. Scott Cancer Center, LSU School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 이주는 배아 개발, 조직 복구, 면역 체계 기능, 그리고 종양 침공 1, 2를 위해 중요하다 역동적인 과정이다. 방향 마이 그 레이션하는 동안 세포는 세포외 chemotactic 신호에 대응하거나, 기본적인 운동성 기계에서 제공하는 본질적인 단서 3 응답으로 급속하게 이동합니다. 세포는 세포가 자신의 로컬 환경을 탐험 있도록 낮은 본질적인 방향성을 가지고하면 랜덤 마이 그 레이션이 발생합니다.

세포 이주는 초기 응답 세포에서 복잡한 과정이다 분극을 거쳐 및 마이 그 레이션 2의 방향으로 라고나을 확장합니다. 이러한 Boyden 챔버 마이 그 레이션 분석과 같은 마이 그 레이션을 측정하는 전통적인 방법은 끝점 결과로 마이 그 레이션을 측정하는 수 체외에서 chemotaxis를 측정하기위한 쉬운 방법입니다. 그러나,이 접근법은 역시 개별적인 마이 그 레이션 매개 변수의 측정을 허용하지 않으며 그것은 visua 수 있습니까세포가 마이 그 레이션하는 동안 겪습하는 형태학의 변경 lization.

저속 현미경 - 여기, 우리는 비디오를 사용하여 실시간으로 이주하는 세포를 관찰 할 수 있습니다 방법을 제시한다. 세포 이주와 침략이 암의 특징이기 때문에이 방법은 체외에서 암 세포 이주와 침략을 연구에 적용 될 것입니다. 혈소판의 무작위 마이 그 레이션은 혈소판 기능 4의 매개 변수 중 하나로서 간주되었으며, 따라서이 방법은 또한 혈소판 기능을 공부에 많은 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 신속하고 안정적​​인 재현성 적의를 가지고 있으며, 세포 숫자의 최적화가 필요하지 않습니다. 세포 생리학을위한 적합한 조건을 유지하기 위해서는 현미경이 CO 2 공급 및 온도 자동 온도 조절 장치를 갖추고 있습니다. 세포 운동은 정기적으로 현미경에 장착 카메라를 사용하여 사진을 찍고 의해 모니터링된다. 세포 이주는 측정 평균 속도로 계산할 수Slidebook 소프트웨어에 의해 계산됩니다 verage 변위.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 접시의 준비는 콜라겐으로 코팅

  1. 10 μg / Opti-가상 미디어 ML의 최종 농도로 콜라겐을 희석.
  2. 1 단계에서 각도에 1.5 ML를 추가하여 콜라겐과 코트 6 잘 접시. 4에서 하룻밤 품어 ° C.
  3. 다음 날, 1X 인산 2 번 식염수 (PBS)를 버퍼 접시를 씻고 PBS에 그들을 저장합니다.

2. 6 - 잘 접시에 세포 준비 및 심는

참고 : 세포의 움직임을위한 최적의 조건을 보장하기 위해 따뜻한 매체와 PBS를 사용

  1. 성장 MDA-MB-231 (침입 유방암 세포주) 띄엄띄엄 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) 인치 이 예제에서, 우리는 MDA-MB-231을 사용하지만,이 방법은 어떤 자기편 종양과 비 종양 세포 라인에 적용할 수 있습니다.
  2. 따뜻한 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 trypsinization에 의해 수집합니다. 통화를 만들기 위해 현미경으로 세포를 검사세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분리되는 재.
  3. 10% FBS으로 DMEM 배지를 추가하여 세포를 수집, 부드럽게 5 분 1,000그램에서 세포를 다운 스핀. 10% FBS으로 DMEM 배지에 부드럽게 세포 펠렛을 Resuspend.
  4. 부드럽게 아래 위로 pipetting하여 세포 펠렛 봐라. 그것은 가능한 한 각 세포에 세포 클러스터를 무너뜨리는 것이 중요합니다.
  5. 세포를 카운트와 10 % FBS와 50,000 세포 / DMEM 미디어 ML의 최종 농도로 희석. 각도에이 ML을 분배.
  6. 촬영된 현미경을 시작할 때까지 하룻밤 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품어.
  7. 마이 그 레이션을위한 충분한 공간을 확보하기 위해 피펫 팁을 사용하여 상처를 만들고, 파편 (상처의 결과로 형성) 제거와 10 % FBS으로 DMEM을 추가하는 1X PBS로 접시를 씻는다. 떠다니는 세포에 대한 현미경으로 확인합니다. 세포의 큰 숫자가 부동 경우 세척 절차를 반복합니다. 이제 음식에 설치가 될 준비가되어이미지 수집을위한 현미경.

3. 현미경의 설치 및 자동 이미지 인식

자동 이미지 수집을위한 현미경을 제어 여러 이미징 소프트웨어 패키지가 있습니다. 여기서는 Slidebook 5.0 이미징 소프트웨어를 사용하고 자동 인수는 인수와 최소한 phototoxicity 속도 답해야 라이브 셀 애플 리케이션에 뛰어난 EM-하마 마츠 C9100 카메라에 결합 올림푸스 현미경 (올림푸스 IX81)에서 수행됩니다. 시스템은 무대 최고 환경 제어 챔버 (Neue 라이브 셀) 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러를 (사전 Proscan)가 포함되어 있습니다. 이미지가 정의된 시간 간격을 이용한 명시야 모드에서 10X UPLANFL Ph1/0.30 목표, 함께 찾았습니다. 다음 프로토콜은 이미지 수집에 대해 설명합니다.

  1. 현미경, 카메라, 그리고 라이브 세포 이미징 장치를 켭니다. 미세한 무대 위에 접시를 놓습니다. Neue 라이브 셀 envi에 의해 커버 플레이트CO 2 공급 및 온도 센서와 연결되어 ronmental 제어 챔버. 37 5 % ° C와 CO 2에서 온도 조절 장치를 설정합니다.
  2. SlideBook 소프트웨어는 완전 자동화된 객관적인 선택, 파장 선택과 형광 및 명시야 기법간에 쉽게 전환이 가능합니다. 초점 제어의 여러 매개 변수를 설정하기 위해서는 오픈 SlideBook 소프트웨어> 클릭하여 메뉴 모음> 선택 초점 컨트롤로 이동> figure-protocol-1 그리고 다음 매개 변수를 선택
    1. 에서 '대상 상자에서 "창 드롭 다운에서 선택하여 목표를 정의합니다. 우리는 위상 목적을 사용하고 수동으로 콘덴서에 적절한 위상 링을 선택합니다. 자동 콘덴서와 시스템을 사용하는 경우이 자동으로 소프트웨어 프로그램을 통해 설정됩니다. 도 객관적인 포탑이나 콘덴서를 자동화하는 경우 또는, 그것들은 사용 설명서를 각각 선택해야합니다그겁니다.
    2. : '필터 설정'상자
      1. 사용 가능한 필터 (Google 시스템에서 카메라에 대해 "Widefield", 접안 렌즈에 대해 "라이브")를 참조하기 위해 드롭 다운 상자에서 접안 렌즈 또는 카메라 중 하나에 빛이 경로를 지시하는 설정을 선택합니다.
      2. brightfield 조명에 적합한 필터를 선택합니다 (우리의 함정에서이 옵션 brightfield 광 경로에 대해 열린 입장을 대표하는 'DIC'(으)로 분류합니다.)
      3. 명시야 셔터를 엽니다 "열기 밝은"를 클릭하여 광원을 선택합니다.
  3. 눈 조각 아래에 샘플을 보려면 포탑에서 명시야 필터 (Google 시스템에서 찾을 위치 "6")를 선택합니다. 초기에 적절한 필드를 찾아 초점 (단계 3.2.1로 3.2.2.3)로 샘플을 가져 접안 렌즈를 통해 샘플을보고 나서. 이미지 캡처 (위치에 Google 시스템에서 "1")를 카메라에 빛의 경로를 변경하려면 필터 터렛을 이동합니다.
  4. 자동화된 단계는 있습니다 다른 XY coordina의 선택이미지 수집 중 관심있는 여러 분야를 캡처하기 위해 오셨. SlideBook 소프트웨어에 초점 컨트롤로 이동 접안경하지만 다른 위치를 선택, "XY"를 선택 후 이미지 캡쳐 (그림 1) 각 지역에서 '세트 포인트'잠금을 클릭합니다.
  5. 미세 조정 화면에 표시될 카메라 이미지의 초점. 이것은 어느 정도 미세한 단위로 초점을 조정할 수 현미경이나 컴퓨터 컨트롤에 수동 컨트롤을 사용하여 수행할 수 있습니다.
  6. "초점 컨트롤"창에서 컨트롤을 사용하여 무대의 Z 위치를 조정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 플레이트와 접촉 근처 평평한 세포 라고나 초점을 맞춥니다.
  7. 초점에 대한 적절한 범위에 있어야 노출 시간을 조정 슬라이더를 사용하여 초점과 투입. 여러 XY 위치가 선택되었을 경우, 각 위치에 대해 초점을 조정 초점 조절> XY> 방문 지점에서. 참고 : 이것은 확실히 회를 만들기 위해 수행됩니다입력란에 정확하게 최적의 스냅샷을 위해 주력하고있다.
  8. 캡쳐 창 매개 변수를 설정하는 소프트웨어를 사용합니다. SlideBook에서 선택하여 캡처를 여십시오 figure-protocol-2 메뉴 표시줄에서. 그림 2를 참조하십시오. 우리는 다음 매개 변수를 확인하십시오.
    1. 저속과 같은 형식> 캡쳐 확인합니다.
    2. 와이드 필드 : DIC (명시야 이미지) 필터 집합을 확인합니다.
    3. "시간 저속 캡처는"(이것은 세포 종류에 따라 다를 수 있음) 캡처됩니다 시간 포인트의 번호입니다. 기간의 실험을위한 시간의 총 길이입니다. 시간의 단위 [밀리초 (MS), 초 (들), 분 (M) 또는 시간 (H)의이] 드롭 다운 메뉴에서 선택할 수 있습니다.
    4. "간격"하나 timepoint의 시작과 다음 timepoint의 시작 사이의 지연이다. 여러분이 이러한 가치관의 두 입력으로 세 번째 필드는 자동으로 계산됩니다.
    5. 다중 XY 캡처 : "멀티를 선택하십시오1 이상 XY 위치에 대한 포인트 목록 ".
    6. 파일의 이름을 지정하십시오. 주어진 예제에서, 우리는 '그것을 '231라는했습니다.
  9. 때문에 여러 개의 이미지로 컴퓨터가 예기치 않게 종료되지 않도록하려면 파일을 저장하기 위해 "스풀 옵션"을 사용합니다. 그것은 선택 사항입니다, 그러나 그것은 매우 권장합니다. 이를 위해 캡처 아래 contro 나> 선택 고급> 스풀> 메모리에 캡처하고 각 시간 지점 이후에 스풀 파일에 저장합니다. 슬라이드 도서 파일 (그림 3)을 저장할 위치를 찾습니다. 생성된 영화가 나중에 지정된 위치에서 가져올 수 있습니다. 현미경 설정의 단계에 요약되어 파일 3.1 .

4. 마이 그 레이션의 이미지 처리 및 분석 : 속도와 배기량의 산출

이 예제에서는 이미지 처리가 SlideBo 이루어집니다확인 5, 6 5.0 소프트웨어. 영상 처리 및 분석을위한 같은 ImageJ 7 등 다양한 다른 프로그램이있다.

  1. 다양한 시간 지점에서 다양한 분야의 이미지에서 생성된 SlideBook 파일을 가져옵니다. 메뉴 표시줄로 이동> 이미지 아래에> 가져오기> 슬라이드 도서 스풀> 원하는 파일 (그림 4A)를 선택합니다.
  2. 여기에서 우리의 목표는 개별 세포의 움직임을 추적하는 것입니다. 그것은 자동 추적이나 개별 추적을 사용하여 수행할 수 있습니다. 예제에서 우리는 수동 추적을 사용한,이 용이 이후는 자동 추적과 어느것이 더 어려 운지 쉽게 유물을 배제할.
  3. 우리가 추적을 수행하기 위해 보유하고있는 SlideBook 파일을 엽니다. 메뉴 아래에 : 선택 마스크> 입자 추적 프로토콜> 매뉴얼 입자 추적 프로토콜 (그림 4B). 창이 시작과 끝 시간 점 (그림 4c)와 함께 나타납니다.
  4. Begi각 세포 (핵)의 중앙을 클릭하여 개별 세포의 움직임을 추적할 수 그렇죠. 약 30 세포가 하나의 실험에서 분석할 수 있도록 각 영화의 약 10 세포 적어도 세 가지 다른 영화를 추적은 서로 다른 위치에서 선택해야합니다. 각 실험은 세 번 반복해야합니다. 불편 접근을 허용하려면 같은 전선에서 일부 세포 등 다양한 위치에서 셀을 선택, 중, 구석 등이 "OK"를 클릭 한 번 추적이 이루어집니다.
  5. 랜덤 마이 그 레이션은 메뉴 아래 자료> 선택 마스크> 입자 추적> 입자 추적 프로토콜을 분석 속도, 속도 또는 변위 등의 변화를 측정하여 분석할 수 있습니다. (그림 5A) : 아래 설명된대로 추적 매개 변수를 선택하십시오 :
    1. 로 추적 - 당신이 드롭 다운 목록에서 추적하고자하는 매개 변수를 선택합니다. 면적이 예제에서 우리가 사용한, 센터 (오브의 중심의 좌표ject).
    2. "추적 및 계속"을 클릭하십시오. 추적이 완료되면,이 자동으로 다음 단계로 진행됩니다.
  6. 같은 변위와 평균 속도 (그림 5B 참조) 각 경로에 대한 원하는 통계를 선택하세요 :
    1. 평균 속도 - 총 거리가 그 거리를 여행하는 데 필요한 시간으로 나눈 여행.
    2. 총 배기량 - 객체에 의해 여행 총 거리.
    3. "계산하고 계속"당신이 다음 단계로 진행하고자하는 경우, 또는 단순히 당신이 다음 단계로가는없이 통계를보고자하는 경우에는 "계산"을 선택 클릭합니다. 파일은 텍스트 파일로 저장할 수있는 생성되며 나중에 Excel로 내보낼 수 있습니다.
  7. 자동 추적 프로토콜을 사용하여 객체를 추적하기 위해서는, 먼저 마스크가 생성되어야한다.
    1. > 세그먼트 이미지> 세그먼트 창이 나타납니다 마스크를 선택> 임계값을 얻을 때까지 선택 등 그 9월다른 사람에서 한 물체를 arating 것은> (그림 5c를 참조)> 확인을 적용합니다. 단계 4.5.1은 동일합니다.
    2. 이상의 객체가 작은 제거 - 선택적으로 지정된 크기보다 작은 물체가 제거하려면이 확인란을 선택합니다. 편집 필드의 크기를 입력하고 단위로 미크론 또는 픽셀 중 하나를 선택합니다. 이것은 자주 파편으로 인한 아티팩트를 제거하는 데 사용됩니다.
    3. 최소 운동 - 경로를 확인하기 위해 추적해야 시간 포인트의 최소 숫자를 입력합니다.
    4. 최대 운동 - 한 시점에서 특정 개체에서 다음을 기대하는 최대 운동을 입력하십시오.
    5. 데이터를 분석하는 단계 (4.6.2 단계 4.5.2 참조) 수동 추적과 동일합니다.

5. 대표 결과

무작위로 마이 그 레이션 분석의 예제는 속도와 변위 (그림 6)의 측면에서 계량. 파일 T를 수출 후O 엑셀은 데이터 상자와 수염의 음모를 꾸몄다 사용하고 있습니다. 테스트 및 제어 사이 총 변위와 평균 속도 비교 통계 분석은 맨 - 휘트니 테스트를 사용하여 수행됩니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 평균 속도 증가를 보여줍니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 총 변위의 증가를 보여줍니다.

제어 및 테스트의 영화 : 제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤 사이에 콜라겐에 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18시간 총 1 시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 영화 1, 제어 및 테스트 샘플에 대한 무작위로 마이 그 레이션의 영화 2를 참조하십시오.

현미경 설정 :

figure-protocol-3
그림 1. 이미지에 대해 여러 포인트 설정하기 캡처.

figure-protocol-4
그림 2. 캡쳐 제어를 묘사한 단계. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

figure-protocol-5
그림 3. 어떻게 여러 개의 이미지를 저장합니다.

"dflinebreak> 마이 그 레이션의 이미지 프로세싱 및 분석.

figure-protocol-6
그림 4A. 데이터 분석을 위해 이미지를 가져오는 단계.

figure-protocol-7
그림 4B. 입자 추적 프로토콜을 사용하여 데이터를 분석하는 단계.

figure-protocol-8
그림 4c. 추적 입자의 창 묘사한 경로 길이.

데이터 분석의 단계.

figure-protocol-9
그림 5A. 입자 추적 프로토콜 매개 변수를 묘사하는 단계.

figure-protocol-10
그림 5B. 분석되는 경로 통계의 선택.

figure-protocol-11
그림 5c 있습니다. 자동 추적 프로토콜에 대한 마스크를 생성하는 단계.

figure-protocol-12
그림 6. 평균 속도 (그림6A)와 변위 (그림 6B)는 수염의 음모를 꾸몄다됩니다. 제어하기 위해 비교로 테스트 샘플은 속도와 변위의 증가를 보여줍니다.

영화

영화 1. 제어 세포 마이 그 레이션이 있습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화 2. 테스트 세포 마이 그 레이션이 있습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤을위한 콜라겐에 띄엄띄엄 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18 시간 동안 일시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 제어 및 테스트를 위해 임의 이주의 동영상을 참조하시기 바랍니다.

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실시간으로 무작위로 마이 그 레이션 분석은 속도와 변위와 같은 세포 이주 매개 변수 중 정확하고 민감한, 분석을 가능하게합니다. 이 방법은 포인트 측정 값을 끝낼 국한되지 않고, 따라서 그것은 더 많은 양적입니다. 이후 세포는 혈청과 정상 DMEM 배지에서 모니터링되며 그것은 혈청 무료 미디어 이상 인큐베이션의 해로운 효과를 감소시킵니다. 이것은 세포 마이 그 레이션이 서식하기 때문에이 방법은 이전에 다른 substrata의 효과를 연구하는 데 사용할 수있는 하층 8로 세포 연락처를 위반에 의존하는 것으로 나타났습니다.

중요한 단계 중 하나는 최적의 마이 그 레이션을 보장하기 위해 37 5 % ° C와 CO 2로 온도의 적절한 통제를 포함한다. 분석은 원하는 시간 지점에서 철새 반응을 모니터링하기 위해 유연성을 허용하지만, 그것은 시간 포인트의 수를 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 마이 그 레이션 속도를 갖는 일부 세포가...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 실험과 초기 도움 아만다 Struckhoff 감사드립니다. 이 작품은 NIH 5RO1CA115706에서 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
DMEM 써모 과학 SH30243.01
FBS 제미 나이 바이오 제품 100-106
Opti-가상 Invitrogen 31985-070
콜라겐 BD 354,231
라이브 셀 챔버 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러와 현미경 올림포스 산 올림푸스 1X81
환경 제어 챔버 Neue Neue 라이브 셀 회의소 와우 챔버의 상단을 통해 적절한 광학 정의 지어진 사각형 유리 플레이트 상단 있습니다. 직사각형 모양의 experimen 많은에 사용되는 멀티 잘 번호판을 수용TS.
자동 XY 스테이지 이전에 이전 Proscan 이것은 정확한 반환 시간 저속 현미경 중에 선택한 XY 위치를 곱하면 수 있습니다.
카메라 하마 마츠 EM 카메라 C9100
소프트웨어 일반적으로 이러한 올림푸스 현미경 같은 공급 업체를 통해 구입 슬라이드 도서 5

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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